利用蛋白质组学技术建立澳大利亚啤酒大麦醇溶蛋白标准图谱

游丽华,李晓敏,王迎新,蔡国林,陆 健,4*

(1.江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡 214122;2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡 214122;3.江南大学生物工程学院,江苏无锡 214122;4.宿迁市江南大学产业技术研究院,江苏宿迁 223800)

利用蛋白质组学技术建立澳大利亚啤酒大麦醇溶蛋白标准图谱

游丽华1,2,3,李晓敏1,2,3,王迎新1,2,3,蔡国林1,2,3,陆 健1,2,3,4*

(1.江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡 214122;2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡 214122;3.江南大学生物工程学院,江苏无锡 214122;4.宿迁市江南大学产业技术研究院,江苏宿迁 223800)

啤酒大麦的品种和质量与麦芽的制作和啤酒的酿造紧密相关。选取国内常用的3个进口澳大利亚啤酒大麦品种Hindmarsh、Schooner、Vlamingh及国产啤酒大麦品种苏啤3号和苏啤6号为研究对象,获得这5种啤酒大麦醇溶蛋白的标准双向电泳图谱,通过图像分析结合基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)鉴定技术,对各品种澳麦电泳图谱上的10个差异明显的特征蛋白质点和共同存在于这3个品种澳麦图谱上的43个共同蛋白点进行了鉴定,共成功鉴定出7个特异蛋白点和34个共同蛋白点,这些蛋白质点构成了以上3种啤酒大麦的蛋白标志物库。本研究为啤酒厂和麦芽厂的进口啤酒大麦品种鉴定提供依据。

啤酒大麦,醇溶蛋白,蛋白质组学,品种鉴定,双向电泳

啤酒大麦是啤酒酿造的主要原料。近几年,国产啤酒大麦供应量增加,但在质量上仍存在不足[1],诸如品种混杂、蛋白质含量高、麦汁浸出率低、皮壳厚、溶解慢等问题,而进口啤酒大麦则在浸出率、发芽率上占有质量优势,与国产大麦相比更适宜于啤酒酿造。因此,我国酿造啤酒的原料大麦长期依赖于进口,主要进口国为澳大利亚和加拿大[2]。由于进口大麦品质优售价高,因而市场上常出现其他大麦混入进口一级大麦的情况,影响到啤酒的生产及其品质。因此,有必要对进口啤酒大麦进行品种纯度及真实性鉴定。

传统的大麦品种鉴定方法有感官鉴定法[3]和物理化学鉴定法[4-5]。随着分子生物学技术的发展,生物化学及分子生物学方法应运而生,Draper实验认为大麦种子醇溶蛋白SDS-PAGE电泳图谱可作为品种的生化“指纹”,用于品种和纯度的鉴定[6];Weiss等分别采用醇溶蛋白SDS-PAGE电泳和糖蛋白印迹两种方法对20种大麦进行分组[7-8];林艳等利用SDS-PAGE电泳技术建立了8个加拿大啤酒大麦品种、3个澳大利亚啤酒大麦品种和4个法国啤酒大麦标准SDS-PAGE图谱库[9-10]。但是,SDS-PAGE等方法存在分辨率低的问题,使得鉴定结果不够准确[11]。国外已有利用蛋白质组学的方法对啤酒大麦相关蛋白质做过研究,而利用该技术进行大麦品种鉴定的文献报道却很少[12-16],且与我国进口的啤酒大麦品种有差别,无法满足我国对进口啤酒大麦品种鉴定的需求,因而,需要对大麦种子蛋白质组作进一步分析[17]。

图1 大麦种子醇溶蛋白的提取Fig.1 Extraction procedure of barley seed hordein

本文对国内麦芽公司常用的3个进口澳大利亚啤酒大麦(Hindmarsh、Schooner、Vlamingh,目前国内啤酒行业普遍使用的澳大利亚啤酒大麦)和2个江苏啤酒大麦(目前国内啤酒行业普遍使用的江苏啤酒大麦)分别进行研究,利用蛋白质组学技术建立各啤酒大麦品种醇溶蛋白标准图谱库和蛋白质标志物库,为啤酒厂和麦芽厂的进口啤酒大麦品种鉴定提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 啤酒大麦样品 进口澳麦Vlmingh、Hindmarsh、Schooner由国内某麦芽公司提供;江苏啤酒大麦苏啤3号、6号由江苏省盐城农科院提供。所有啤酒大麦均为2012～2013年度样品。

1.1.2 实验试剂 琼脂糖、溴酚蓝、碘乙酰胺(IAM)、二硫苏糖醇(DTT)、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、N,N,N′N′-四甲基乙二胺(TEMED)、尿素、硫脲 为GE公司产品;矿物油、17cm IPG胶条(pH3～pH10,非线性)、载体两性电解质(pH3～10,非线性)为Bio-Rad公司产品;α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、碳酸氢铵、三氟乙酸(TFA)、胰蛋白酶、乙腈等购于Sigma公司;30%丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠(SDS)、过硫酸铵(APS)、考马斯亮蓝G-250、考马斯亮蓝R-250、牛血清蛋白、Tris、蛋白标准物 为上海生工进口分装产品;其余试剂为分析纯产品,购于国药集团试剂公司。

1.2 仪器与设备

EttanTMIPGphor III等电聚焦仪、EttanTMDALT Six垂直电泳系统、Image Scanner扫描仪 瑞典GE公司;Ultraflextreme串联飞行时间质谱仪 德国Bruker公司。

1.3 实验方法

1.3.1 醇溶蛋白的分级提取 啤酒大麦种子经粉碎处理液氮研磨至粉末状,称取3g粉末先后经过去离子水、5%(w/v)NaCl及75%(v/v)乙醇分级提取,得到大麦醇溶蛋白,具体详见图1[18]。

采取三氯乙酸(TCA)-丙酮法[19]沉淀蛋白,即向蛋白上清液中加入4倍体积20%的预冷的TCA丙酮溶液,摇匀,-20℃过夜放置沉淀蛋白,4℃、12000r/min离心30min。弃上清,收集沉淀,加入一定体积预冷的丙酮溶液,清洗沉淀,4℃、12000r/min离心20min。重复清洗2次,弃上清,收集沉淀,自然晾干使丙酮完全挥发;将醇溶蛋白溶解于适量的蛋白裂解液(8mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%(w/v)CHAPS、0.8%(w/v)两性电解质及1%(w/v)DTT),置于-20℃冰箱中保存。利用Bradford方法[20]测定蛋白质浓度。

1.3.2 醇溶蛋白的双向电泳 选用长度17cm的IPG胶条,(pH3～pH10,非线性),蛋白样品(500～800μg)加入水化液至终体积350μL。取出胶条室温下放置10min,沿水化槽加入样品,用镊子轻轻去除IPG胶条上的保护层。将IPG胶条胶面朝下放入水化液上,避免产生气泡,盖上矿物油。将胶条槽放入Ettan IPGphor III 等电聚焦仪,聚焦程序见表1。

等电聚焦完成后,用镊子取出胶条,胶面朝上放在湿润的滤纸上,吸去支持膜上的矿物油,将胶条放入胶条盘内(胶面朝上),利用两步平衡法进行胶条平衡:平衡液母液+1% DTT,15min;平衡液母液+1.25% IAM,15min。胶条平衡液母液:8mol/L尿素,2% 十二烷基磺酸钠(SDS),50mmol/L Tris-HCl(pH6.8),30%(v/v)甘油,0.002g/L溴酚蓝。

表1 等电聚焦程序Table 1 Isoelectric focusing electrophoresis program

胶条平衡后转移至配制好的12.5%丙烯酰胺凝胶上,用0.5%琼脂糖封住凝胶上部,进行二向SDS-PAGE电泳:先2W/gel电泳1h,然后调至14W/gel,当溴酚蓝指示剂迁移到凝胶底部时,关闭电源,结束电泳。剥离凝胶,置于考马斯亮蓝G-250染色液中染色过夜,置脱色液(3%冰醋酸)中脱色(约5～8h),直到背景无色透明,蛋白点清晰为止[21]。

1.3.3 凝胶图像分析 使用Image Scanners扫描仪对凝胶进行扫描并保存图像;用PDQuest 8.0软件对凝胶图像上的蛋白点进行检测,所有图像选择自动找点模式,并手动校正以去除背景噪音和横纵条纹。对不同样品的双向电泳图谱选择匹配和对比分析,找出差异蛋白点。为避免系统误差,每个样品需要进行三次实验重复。

1.3.4 质谱鉴定(MALDI-TOF/TOF) 通过软件分析得到的差异蛋白点进行手动切胶,将挖取的蛋白点凝胶转移至EP管中,加入200μL脱色液(30%乙腈/0.1%TFA的碳酸氢铵溶液),震荡脱色至胶粒呈无色。弃掉脱色液,胶粒用50μL的乙腈脱水两次,得到白色胶粒。每个脱水后的胶粒加入5μL胰蛋白酶溶液,置于4℃吸收30～60min,使胶粒充分吸胀,结束后吸出未被吸收的酶液,加入20μL、25mmol/L碳酸氢铵溶液覆盖胶粒,37℃水浴酶解20h。酶解液吸出后加到新的EP管中,原管中加入20μL、60%乙腈/0.1% TFA萃取液,超声15min,冻干待用[21]。

冻干的酶解样品用3μL、0.1% TFA复溶,将0.7μL CHCA基质溶液与0.7μL酶解液先后点在Anchorchip靶板中心的疏水区。再用2μL、0.1% TFA进行脱盐。一级质谱采用正离子模式,二级质谱分析几个强度较高的一级图谱峰,用Mascot软件(http://www.matrixscience.com)在NCBInr数据库中对蛋白质的质谱数据进行搜索匹配。

2 结果与讨论

本研究根据2012～2013年度我国进口澳麦量,选取主要品种Hindmarsh、Schooner和Vlamingh,以及国内产量较高的江苏啤酒大麦苏啤3号和苏啤6号进行研究。

2.1 各啤酒大麦醇溶蛋白的双向电泳图谱

对Hindmarsh、Schooner、Vlamingh、苏啤3号和苏啤6号,分别提取醇溶蛋白,并进行双向电泳,获得醇溶蛋白图谱。为减小误差,每个大麦样品进行3次重复,得到其醇溶蛋白标准图谱如图2。

图2 不同品种啤酒大麦醇溶蛋白2-DE图谱Fig.2 2DE maps of hordeins from different barley cultivars注:a. Hindmarsh;b. Schooner;c. Vlamingh;d. 苏啤3号;e. 苏啤6号。

采用pH3～pH10(图谱上从左至右pH变化范围为3到10)的非线性胶条,既保证了绝大部分等电点(pI4～6和pI8～9)的蛋白质能够展现在凝胶图谱上,同时避免了由于蛋白质过多造成图谱上蛋白质斑点集中、无法有效辨别的情况。从图中可以看出,蛋白质点清晰,无明显横条纹或纵条纹,双向电泳分离效果较好,从肉眼观察看,各品种醇溶蛋白点在图谱上分布形状和位置有明显不同,再次证明醇溶蛋白可作为啤酒大麦品种标记物,且可初步通过各品种醇溶蛋白在二维凝胶图谱上的分布状态对品种进行初步鉴定。

经PDQuest软件分析,各进口啤酒大麦醇溶蛋白图谱中检测到约50个蛋白质点,发现各品种间存在多个共同的蛋白点及明显的差异蛋白点。苏啤3号和苏啤6号电泳图谱存在明显的差异,进口啤酒大麦与江苏啤酒大麦的醇溶蛋白图谱也存在明显差异,与国产啤酒大麦醇溶蛋白图谱相比,进口啤酒大麦醇溶蛋白质点在图谱上分布较清晰,且无明显的横纵条纹,可能是与啤酒大麦的品种及其质量有关。实验结果表明,通过分级提取方法建立的双向电泳图谱重复性好,分辨率高,适合用构建大麦种子蛋白的双向电泳图谱。

2.2 啤酒大麦醇溶蛋白图谱中共同蛋白点分析

成熟的大麦籽粒中,醇溶蛋白约占总蛋白含量的40%～60%,根据分子量的不同,可将其分为A(或γ)、B、C和D四组多肽,B(28～45ku)和C(49～72ku)组分别占总醇溶蛋白的70%～80%和10%～20%,且它们在蛋白组成上差异明显,适宜用于大麦品种鉴定[22]。

表2 34个蛋白点鉴定结果Table 2 Results of 34 identified protein spots

注:a为大麦;b为小麦;c为藓类;d为微细胞藻类;e为藻类。

利用PDQuest8.0软件,对获得的3个澳大利亚啤酒大麦品种及2个品种的江苏啤酒大麦醇溶蛋白标准图谱进行分析,选择Hindmarsh为参考谱图,在5个品种大麦图谱中共检测到43个共同蛋白点,见图3。

图3 啤酒大麦标准图谱中共同蛋白点Fig.3 Common proteins of hordeins of barley standard 2DE maps

对图谱上的共同蛋白点进行串联质谱鉴定,成功鉴定34个蛋白点,其余9个点可能由于蛋白点浓度低或数据库不完整鉴定不成功,通过数据库检索得到共同蛋白点鉴定结果如表2。结果显示大部分蛋白点鉴定为大麦醇溶蛋白,如B组、C组和D组醇溶蛋白,或为醇溶蛋白前体物,另外一部分蛋白点鉴定为α-淀粉酶抑制剂和胰蛋白酶抑制剂家族,这类蛋白可溶于氯仿/甲醇,因此也属于醇溶蛋白;此外,还有少量鉴定出的假定蛋白和未知蛋白。

2.3 3个澳麦品种标准图谱中特异蛋白点分析

利用软件PDQuest 8.0对3个品种大麦的标准图谱进行分析,得到各品种澳麦标准图谱中差异较明显的特异蛋白点(见图4中箭头所指的点),分子量主要分布在14.4 ～66.2ku。

图4 进口啤酒大麦醇溶蛋白图谱差异蛋白分析Fig.4 Variance analysis of 2-DE maps of imported barley hordein注：a. Hindmarsh;b. Schooner;c. Vlamingh。

各图谱中的特异点经MALDI-TOF/TOF 质谱鉴定(表3),共挖取10个特异蛋白点,成功鉴定出7个,其中D-hordein为Hindmarsh的特异蛋白(由于挖取的蛋白质点颜色浅浓度低或数据库不完整,其余3个蛋白点未成功鉴定出);Schooner品种中的特异蛋白为BTI-CMe 2.2 protein和α-淀粉酶抑制剂 BDAI-1;鉴定得Vlamingh的差异蛋白为:α-amylase/trypsin inhibitor CMa、BTI-CMe 1、hordoindoline A-1、B3-hordein。对这3个品种澳麦图谱进行选择匹配和对比分析,共鉴定出34个共同蛋白点,及7个属于每个品种的特异蛋白,这些蛋白点构成了这3个澳麦品种的蛋白标志物库。

表3 差异蛋白点质谱鉴定结果Table 3 Results of protein spots by mass spectrometry

各品种大麦醇溶蛋白图谱中的特异蛋白,可作为品种鉴定的标志物,如通过提取未知大麦样品的蛋白质并进行目标品种特征蛋白的质谱扫描,通过特征蛋白质谱信号的有无判断是否为目标品种大麦;或通过混种实验针对目标品种特征蛋白或其mRNA,利用Western或RT-PCR等定量方法,建立目标品种大麦纯度与特征蛋白表达量之间的标准曲线,为开发高效准确鉴定大麦品种及纯度的方法提供技术基础。

3 结论

本研究以近年来进口量较大的3个进口澳大利亚啤酒大麦Hindmarsh、Schooner、Vlamingh及2个产量较大的江苏啤酒大麦苏啤3号、苏啤6号为研究对象,通过双向电泳实验,建立了各进口啤酒大麦及国产大麦醇溶蛋白标准图谱,发现了进口啤酒大麦品种特异蛋白,其中,D-hordein、BTI-CMe 2.2 protein和α-amylase inhibitor BDAI-1、α-amylase/trypsin inhibitor CMa可分别作为Hindmarsh、Schooner和Vlamingh的特异蛋白,对于未鉴定成功的特征蛋白,还需要对其使用价值进行进一步评价,为啤酒大麦品种鉴定提供技术依据。

采用双向电泳及质谱鉴定技术相结合的蛋白质组学技术对啤酒大麦进行品种鉴定,避免了传统鉴定技术结果的不准确性及SDS-PAGE电泳分辨率低等问题。近几年来,蛋白质组学以其大规模、高通量、高灵敏度、全局性的技术优势[23],在发现新型生物标志物、药靶和药物的重要途径等生物医药及相关领域迅速发展[24]。而得益于模式植物基因组的测序工作和蛋白质鉴定技术发展的植物蛋白质组学也将取得更深远的进展,在大麦品种和纯度鉴定中将发挥重要作用。

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Proteomic profile of hordeins from different varietiesof Australian malting barley

YOU Li-hua1,2,3,LI Xiao-min1,2,3,WANG Ying-xin1,2,3,CAI Guo-lin1,2,3,LU Jian1,2,3,4，*

(1.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;3.School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;4.Industrial Technology Research Institute of Jiangnan University in Suqian,888 Renmin Road,Suqian 223800,China)

The properties and cultivars of malting barley are closely related with malt production and brewing process. Three commonly used Australia malting barley varieties(Hindmarsh,Schooner and Vlamingh),and domestic Supi#3 and #6 were investigated. Then standard two-dimensional electrophoresis profiles of hordeins from those five malting barley were obtained. Ten characteristic protein spots with significant differences of each malting barley cultivar and forty-three common protein spots of the three Australia barley maps were identified with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight(MALDI-TOF/TOF),and seven characteristic proteins and thirty-four common proteins were successfully identified for constructing the protein marker library of the five malting barley cultivars. This research provided a basis to promote application of this technology in domestic brewery and malting companies.

malting barley;hordein;proteomics;variety identification;two-dimensional electrophoresis(2DE)

2014-07-24

游丽华(1988-),女,硕士研究生,研究方向：酿酒科学与工程。

*通讯作者:陆健(1968-),男,博士，教授,主要从事酿造酒微生物与酶技术研究。

国家重点基础研究发展计划项目(2013CB733602);国家863计划(2013AA102109);国家自然科学基金项目(31171736);中央高校基本科研业务费专项资金项目(JUSRP1015);江苏省普通高等学校科研成果产业化推进项目(JHB2012-26);江苏省科技支撑计划项目(BE2012397);安全食品精深加工科技创新平台建设(2012B091400030);江苏高校优势学科建设工程资助项目。

TS261

A

1002-0306(2015)13-0282-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.051