血管生成素-1在急性呼吸窘迫综合征患者外周血中的变化及与预后的关系＊

丁 浩， 朱 莉， 王 剑△

江苏大学附属人民医院1呼吸内科2肾内科，镇江 212002

急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是一种急性进行性缺氧性呼吸衰竭，可由多种原发疾病引起，以肺顺应性下降、容积减小及通气／血流比例严重失调为特征，具有较高的病死率［1］。目前，ARDS具体发病机制尚不明确，虽然呼吸支持技术的改进使其病死率有所降低，但仍是导致患者死亡的重要原因。研究表明［2－3］，不同原发病因所致的 ARDS均引起患者肺血管内皮及肺泡上皮屏障通透性增加，使肺泡中出现大量蛋白性液体而导致肺水肿。血管生成素－1（angiopoietin-1，Ang-1）是 Ang重要亚型，在血管内皮增殖、稳定、凋亡及血管通透性方面发挥重要作用［4］。动物实验表明［5］，将小鼠 Ang-1基因敲除后，血管内皮细胞失去与周围基质的连接，而使血管通透性增加。有研究采取动物实验的方法给予高氧诱导肺损伤大鼠外源性Ang-1，可改善其炎症反应及血管通透性［6］。本研究利用 RT-PCR技术对Ang-1在ARDS患者外周血中的表达进行检测，探讨Ang-1在ARDS发病、诊断及判定预后中的价值，以期为临床实践提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年6月至2015年1月在江苏大学附属人民医院呼吸科及重症医学科接受治疗的ARDS患者85例，所有患者均符合“柏林定义”关于ARDS诊断标准［7］。病例排除标准：①年龄在18岁以下者；②住院时间在24h以内者；③合并有恶性肿瘤、免疫系统疾病及使用免疫抑制药物者；④孕妇及哺乳期妇女；⑤肺结核活动期、支气管哮喘、COPD急性加重期、间质性肺病等所致的ARDS。其中，男性56例，女性29例，平均年龄（58.7±15.3）岁；原发疾病类型：肺部感染31例，急性化脓性胆管炎8例，急性腹膜炎10例，多发伤合并肺挫伤9例，脓毒血症8例，重症胰腺炎7例，严重失血性休克7例，化脓性脑膜炎2例，农药中毒3例。根据患者氧化状态进行分组：轻度组（n＝25）：200＜氧合指数（PaO2／FiO2）≤300，且持续气道正压（CPAP）或呼气末正压（PEEP）＜5cmH2O；中度组（n＝36）：100＜PaO2／FiO2≤200，且5cmH2O≤CPAP或PEEP＜10cmH2O；重度组（n＝24）：PaO2／FiO2≤100，且CPAP或PEEP≥10cmH2O。同期，选取住院治疗的非ARDS患者40例作为对照组，男性27例，女性13例，平均年龄（60.3±17.6）岁；疾病类型：急性脑梗死9例，急性心肌梗死8例，心肺复苏术后4例，消化道出血7例，药物中毒6例，低血糖昏迷3例，胃穿孔术后3例。本研究通过医院伦理委员会批准，所有患者均知情同意。

1.2 临床一般资料收集

收集所有研究对象性别、年龄、原发病、合并症等一般情况，记录患者入院后血尿常规指标、血气指标检查结果，分别对患者进行急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ评分（APACHEⅡ评分）、肺损伤评分（LIS）和序贯器官衰竭评分（SOFA）［8］。

1.3 实验室检测

1.3.1 主要试剂及仪器 总RNA提取试剂盒购自美国MOBIO公司，RT-PCR检测试剂盒购自美国ABI公司，Ang-1、人内皮细胞TEK酪氨酸激酶受体Tie2及内参引物设计和合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，PCR仪购自德国Roche公司，IL-6检测试剂盒购自上海酶联实业有限公司。

1.3.2 RT-PCR检测外周血中Ang-1和Tie2表达所有研究对象入院次日抽取晨起肘静脉血6mL分装在2个试管中，各3mL，分别进行3 500r／min离心后取血浆保存于－70℃冰箱备检。取血浆标本，利用总RNA提取试剂盒对血浆中总RNA进行提取，操作严格按照试剂盒说明书进行，利用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA并定量。取cDNA加入PCR反应体系中进行PCR反应，Ang-1引物序列：上游5′-GAAGGGAACCGAGCCTATTC-3′，下游5′-GGGCACATTTGCACATACAG-3′；Tie2引物序 列：上 游 5′-TACACCTGCCTCATGCTCAG-3′，下 游 5′-TGTGCAGTTCACAAGCCTTC-3′。PCR反应条件：94℃10min，90℃15s，56℃30s，72℃30s，连续进行36次，每个样品均设3个反应复孔。反应产物行琼脂糖凝胶电泳后利用图像分析软件对Ang－1 mRNA和Tie2mRNA表达情况进行分析。

1.4 统计学处理

利用SPSS 21.0统计分析软件进行统计学处理，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，利用Pearson相关分析对变量间相关关系进行分析，利用多因素Logistic回归分析对影响ARDS患者预后的相关因素进行分析，利用受试者工作特征曲线（ROC曲线）对 Ang-1在预测ARDS发生中的效能进行分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ARDS患者和对照组临床一般资料比较

ARDS患者和对照组在性别、年龄方面差异无统计学意义（均P＞0.05），与对照组相比，ARDS患者PaO2／FiO2降低，而APACHEⅡ评分、LIS评分、SOFA评分、C-反应蛋白（CRP）水平、IL-6水平和死亡率均升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；对不同程度ARDS患者比较显示，重度组患者PaO2／FiO2低于中度组和轻度组，而APACHEⅡ评分、LIS评分、SOFA评分、C-反应蛋白、IL-6和死亡率均高于中度组和轻度组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），中度组患者PaO2／FiO2低于轻度组，而LIS评分、SOFA评分、C-反应蛋白和IL-6均高于轻度组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 ARDS患者和对照组临床一般资料比较（±s）Table 1 Comparison of general clinical data between the ARDS patients and the control subjects（±s）

表1 ARDS患者和对照组临床一般资料比较（±s）Table 1 Comparison of general clinical data between the ARDS patients and the control subjects（±s）

与对照组比较，aP＜0.05；与轻度组比较，b P＜0.05；与中度组比较，c P＜0.05

指标 对照组（n＝40） ARDS患者合计（n＝85） 轻度组（n＝25） 中度组（n＝36） 重度组（n＝24）性别（男／女） 27／13 56／29 15／10 23／13 16／8年龄（岁） 60.3±17.6 58.7±15.3 59.6±16.2 58.3±15.1 57.9±15.3 PaO2／FiO2 396.5±59.4 161.4±57.3a 241.2±23.5 154.8±25.3b 92.4±8.5bc APACHEⅡ（分） 13.9±5.1 19.8±4.8a 17.3±3.3 19.4±4.9 23.8±3.7bc LIS（分） 0.26±0.13 1.71±0.65a 0.93±0.17 1.68±0.45b 2.49±0.38bc SOFA（分） 3.4±1.9 7.5±3.2a 5.3±2.1 7.6±3.1b 9.7±3.2bc CRP（mg／L） 13.5±4.3 97.8±11.5a 71.5±12.7 98.3±13.1b 151.4±15.2bc IL-6（ng／L） 12.9±5.4 55.7±12.5a 42.5±9.8 49.6±11.3b 128.7±13.8bc死亡率（n，%） 7（17.5） 38（44.7）a 6（24.0） 16（44.4） 16（66.7）b

2.2 ARDS患者和对照组外周血中Ang-1和Tie2表达情况

ARDS患者外周血中 Ang-1mRNA和Tie2 mRNA相对表达量均低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；对不同程度ARDS患者比较显示，重度组患者外周血中 Ang-1mRNA和 Tie2 mRNA相对表达量均低于中度组和轻度组，且中度组均低于轻度组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2 ARDS患者和对照组血浆中Ang-1和Tie2mRNA表达（±s）Table 2 Expressions of Ang-1and Tie2mRNA in the plasma of ARDS patients and control subjects（±s）

表2 ARDS患者和对照组血浆中Ang-1和Tie2mRNA表达（±s）Table 2 Expressions of Ang-1and Tie2mRNA in the plasma of ARDS patients and control subjects（±s）

与对照组比较，aP＜0.05；与轻度组比较，b P＜0.05；与中度组比较，c P＜0.05

组别 n Ang 40 3.47±1.14 1.54±0.91 ARDS患者 85 1.85±0.93a 0.87±0.47a轻度组 25 2.30±1.04 1.33±0.79中度组 36 1.81±0.90b 0.82±0.43b重度组 24 1.27±0.82bc 0.54±0.26-1mRNA Tie2mRNA对照组bc

2.3 ARDS患者外周血中Ang-1和Tie2表达与其他临床指标相关性分析

Pearson相关分析显示，ARDS患者外周血中Ang-1mRNA和 Tie2mRNA表达均与PaO2／FiO2呈正相关（均P＜0.05）；而与 APACHEⅡ、LIS、SOFA、C-反应蛋白和IL-6呈负相关（均P＜0.05），见表3。

表3 ARDS患者外周血中Ang-1和Tie2mRNA表达与其他临床指标相关性分析Table 3 Analysis of the correlation of the expressions of Ang-1 and Tie2in the peripheral blood of ARDS patients with other clinical parameters

2.4 ARDS患者死亡相关危险因素分析

根据患者28d死亡情况，分为生存组（n＝47）和死亡组（n＝38），对有关影响因素进行多因素Logistic回归分 析。结果显示，PaO2／FiO2和 APACHEⅡ评分是ARDS患者死亡的独立危险因素（P＜0.05），而 Ang-1mRNA和 Tie2mRNA 相对表达量则是ARDS患者死亡的的保护性因素（均P＜0.05），见表4。

表4 ARDS患者死亡相关危险因素多因素Logistic回归分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis of the risk factors for death in ARDS patients

2.5 外周血的Ang-1和Tie2表达在ARDS患者诊断中的价值

ROC曲线分析显示，Ang-1mRNA相对表达量在诊断ARDS患者时的ROC曲线下面积为0.874（95%CI：0.809～0.938），灵敏度为72.5%，特异度为85.9%，Tie2mRNA相对表达量在诊断ARDS患者时的ROC曲线下面积为0.824（95%CI：0.737～0.911），灵敏度为62.5%，特异度为92.9%，见图1。

图1 外周血Ang-1和Tie2mRNA的表达在ARDS患者诊断中的价值Fig.1 Diagnosis values of the expressions of Ang-1and Tie2mRNA in the peripheral blood of ARDS patients

3 讨论

ARDS患者发生急性肺水肿是导致患者呼吸功能不全或衰竭而造成死亡的重要原因［9］，研究表明［10］，肺泡上皮细胞及肺毛细血管内皮细胞损伤是造成肺泡及肺间质水肿的病理基础。随着多种致病因素作用于肺毛细血管内皮细胞，损伤程度随之增加，使血管通透性改变而加重肺水肿的程度。研究发现［11］，Ang及其受体Tie在血管新生、重塑、成熟及稳定中发挥重要调节作用。Ang-1和Ang-2是Ang家族重要成员，是具特征性的血管生长因子。Ang-1可由多种细胞分泌产生，通过旁分泌而作用于内皮细胞膜上的Tie2受体而对维持内皮细胞稳定发挥重要作用［12］。Ang-2则由血管内皮细胞分泌，可竞争Ang-1与Tie2受体的结合，从而破坏血管细胞稳定性［13］。有研究指出［7］，Ang-2在 ARDS患者血浆中含量显著增加。本研究显示，ARDS患者外周血中Ang-1mRNA和Tie2mRNA相对表达量均低于对照组（均P＜0.05），说明 Ang-1和Tie2在ARDS患者外周血中呈低表达，提示Ang－1表达下调可能是造成ARDS患者肺毛细血管内皮细胞稳定性降低，通透性增加的因素［14］。

本研究对不同程度ARDS患者比较显示，重度组患者外周血中Ang-1mRNA和Tie2mRNA相对表达量均低于中度组和轻度组，且中度组均低于轻度组，Pearson相关分析显示，ARDS患者外周血中Ang-1和Tie2表达均与PaO2／FiO2呈正相关（均P＜0.05）；而与 APACHEⅡ、LIS、SOFA、CRP和IL-6呈负相关（均P＜0.05），说明ARDS患者外周血中Ang-1和Tie2表达与患者病情严重程度有关，患者肺损伤程度越严重，外周血中Ang-1和Tie2表达量越少，从而使血管内皮细胞功能障碍越严重［14］。CRP和IL-6是应激反应和炎性反应的重要标志物［15－16］，本研究显示 ARDS患者病情进展中出现应激反应和炎性因子大量释放，Pearson相关分析显示，ARDS患者外周血中Ang-1和Tie2表达均与CRP和IL-6呈负相关（均P＜0.05），提示Ang－1和Tie2在抗炎反应中发挥重要作用［17］。本研究对影响ARDS患者死亡的因素进行多因素Logistic回归分析显示，PaO2／FiO2和APACHEⅡ是ARDS患者死亡的独立危险因素（均P＜0.05），而Ang－1 mRNA和Tie2mRNA相对表达量则是ARDS患者死亡的保护性因素（均P＜0.05），说明ARDS患者呼吸功能越差和病情越重，越易发生死亡，而Ang-1和Tie2在外周血表达量增加则可减少死亡发生，是重要的保护性因素。动物实验亦显示［5］，敲除小鼠Ang-1基因可导致内皮细胞通透性增加。提示Ang-1和Tie2可作为预测预后的指标，有望为ARDS患者治疗提供新的线索。本研究ROC曲线分析显示，Ang-1mRNA相对表达量在诊断ARDS患者时的曲线下面积为0.874（95%CI：0.809～0.938），灵敏度72.5%，特异度85.9%，Tie2mRNA相对表达量在诊断ARDS患者时的曲线下面积为0.824（95%CI：0.737～0.911），灵敏度62.5%，特异度92.9%，说明检测外周血Ang-1和Tie2表达水平对ARDS患者转归具有一定的预测价值，可作为临床诊断的辅助性指标。

综上所述，Ang-1在ARDS患者外周血中呈低表达，与患者病情严重程度密切相关，可能通过减少与Tie2的结合而加速ARDS患者内皮细胞损伤及增加血管通透性，可作为预测患者预后的参考指标，有望为ARDS患者治疗提供新的线索。

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