结直肠癌患者血清游离DNA的表达及意义*

刘才旺 ，郝天波 ，申娴娟 ，鞠少卿 ，，苏建友 **

（南通大学附属医院1医学检验中心，2外科综合实验室，江苏226001；3吴江市第一人民医院检验科）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在男性肿瘤患者中排名第3位、女性排名第3位[1-2]。结直肠癌的生存率较低，与早期结直肠癌很难发现有很大关系。结直肠癌发现时已处于晚期阶段且缺乏及时、有效的标准化治疗。可接受根治性手术仅有2/3患者，而术后复发率为30%～50%[3]，约50%的患者最终发展为转移性结直肠癌并死于远处转移[4]。因此，提高结直肠癌的早期诊断率、有效的术后监控对于及时发现、治疗及改善预后是至关重要的。肿瘤标志物可作为结直肠癌辅助诊断的指标，临床上应用较为广泛的是癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA），在结直肠癌的早期辅助诊断中具有一定的意义。然而并非所有结直肠癌患者都能被CEA检测出来，它的敏感性仅为43%[5]。因此，近年来国内外致力积极探索一种创伤性小、敏感、可靠的结直肠癌肿瘤标志物对结直肠癌进行辅助诊断、判断预后、病程监控，提高结直肠癌诊断的敏感性。游离DNA（circulating cell-free DNA，cf-DNA）是一种无细胞状态的胞外DNA，主要存在于血液（血清或血浆）、滑膜液和脑脊液等体液中。现普遍认为细胞凋亡和坏死为循环DNA的主要来源[6]，正常组织主要通过细胞凋亡释放产生<200bp的较一致短片段DNA[7]。本实验建立基于ALU序列的实时荧光定量PCR检测游离DNA浓度的方法，收集南通大学附属医院2012年8月—2013年11月结直肠癌104例血清标本经病理确诊，应用该技术检测结直肠良、恶性肿瘤患者及正常人血清DNA的浓度，以探讨血清DNA浓度在结直肠癌早期辅助诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 结直肠癌104例中，男58例，女46例，年龄30～88岁。结直肠良性息肉患者63例中，男44例，女19例，年龄24～84岁。同期门诊体检健康者110例中，男性56例，女性54例，年龄23～84岁。均无自身免疫性疾病和组织损伤的血清标本。本研究经院伦理委员会批准，所有的标本在抽血前得到了受试者的知情同意。

1.2 方法 （1）标本的采集：采用分离胶的真空采集管收集血液标本，1 600g离心10 min后，留取血清2～3m L于高压灭菌的EP管内，-80℃冻存备用。（2）血清DNA的提取：将游离DNA提取试剂盒内的样品混合液分别加入96孔板的第1及第7列孔中，再分别加入20μL磁珠，200μL血清样品和314μL混合液（按照10μL蛋白酶K、4μL核酸助沉剂、300μL裂解液的比例预先混匀）。按表1在96孔板中加入试剂；加完样的96孔板放入磁珠提取纯化系统内，自动化程序结束后，将第6及第12列的洗脱液转移至干净的无核酸酶离心管中，-20℃保存备用。（3）实时荧光定量PCR：PCR体系为20 μL，包括DNA模板5μL、上引0.5μL、下引0.5μL、SYBR GreenⅠmix 10 μL、dd H2O 4 μL。混匀，瞬时离心。反应条件为 95℃ 10 min；95℃ 15 s，64℃ 1 min，35 个循环；64℃～95℃收集荧光绘制熔解曲线，通过熔解曲线验证特异性。

表1 游离DNA提取液的体系

1.3 统计学处理 用SPSS17.0软件进行统计分析，用Graphpad Prism5版软件进行绘图。各组血清cf-DNA浓度用中位数（四分位数区间）表示；计量指标以均数±标准差（x¯±s）表示，两独立样本比较，采用Mann-Whitney U检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 线性 将浓度为222μg/m L的人类基因组DNA标准品10倍梯度稀释（0.222～22200 ng/m L）后绘制标准曲线。ALU115作为引物时，Y=-3.27X+21.56，R2=0.998；根据扩增效率（E%）=（10-1/斜率-1）×100%计算得出该法扩增效率为EALU115%=102.21%，说明该检测方法可检测血清中不同浓度的cf-DNA，线性良好（图1）。

图1 ALU115扩增的标准曲线

2.2 重复性 以浓度分别为2220、222、22.2 ng/mL的人类基因组DNA标准液，同一批重复做20个测定，计算批内CV（表2）；将3个浓度的同1份标准品等份分为20份，分别每天5个，连续测定4天，以每个浓度20个测定结果计算批间CV（表3）。

表2 检测的批内变异系数（x¯±s）

表3 检测的批间变异系数（x¯±s）

2.3 特异性 如图2可见，荧光定量PCR熔解曲线单峰特异，说明特异性较好，ALU115熔解温度为78.03℃左右，ALU247熔解温度为81.23℃左右。

图2 ALU115bp扩增的熔解曲线

2.4 结直肠癌、结直肠息肉与对照组血清ALU115表达水平 用上述所建立的方法，对结直肠癌患者104例、结直肠息肉患者63例和正常对照者110例血清ALU115表达水平进行检测。两组间用Mann-Whitney U检验进行统计分析，结直肠癌患者血清ALU115水平中位数 1046.0（582.7～1694.0）ng/mL 显著高于结直肠息肉423.3（254.5～608.9）ng/mL和正常对照组 385.4（205.7～597.1）ng/mL（P 均<0.001），而结直肠息肉和对照组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。当血清ALU115含量为694.0 ng/mL时，约登指数最大，因而选取694.0 ng/mL作为ALU115的临界值（图 3）。

图3 结直肠癌、结直肠息肉和对照组血清ALU115表达水平

2.5 ALU115与CEA的联合检测 结直肠癌初诊患者血清ALU115和CEA二者联合检测灵敏度、特异性、准确度、阳性预测值和阴性预测值分别是82.69%、99.09%、91.12%、98.85%和 85.82%，其中灵敏度、准确度、阴性预测值高于两个指标单独检测（表 4）。

表4 ALU115和CEA联合检测

3 讨 论

在ALU序列的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测血清游离DNA的基础上，本研究建立了一这种较灵敏、特异、稳定的基于ALU序列的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测血清游离DNA的方法。并采用磁珠法提取血清DNA，这是一种快速、高通量、高产量的自动化提取方法。对于实验中缩小人为误差、保证标本较高的重现性起到了重要的作用。方法学的建立为后期的实验研究奠定了良好的基础。

在前人研究的基础上[8-10]，我们用实时荧光定量PCR法，扩增ALU序列的115bp来检测血清DNA的总浓度。之所以选择ALU序列，是因为ALU家族是灵长类基因组特有的、含量最丰富、最活跃的中度重复序列。是短散在重复序列中最大的一个家族，占人类基因组的5%～10%。以不同的密度分散于整个基因组中，即基因组全部基因的3/4都和ALU有关[11]。ALU序列的种属特异性和高度重复性能被用于肿瘤标本中人类基因组DNA的量化[12]。

在这项研究中，通过自建ALU-qPCR方法检测结直肠癌初诊患者104例、结直肠息肉患者63例和正常对照者110例血清标本中的ALU115水平。结果表明，结直肠癌初诊患者血清ALU115指数明显高于其它两组（P均<0.001），而结直肠息肉和对照组间差异无统计学意义（P>0.05），以血清ALU115含量694.0 ng/mL作为诊断结直肠癌初诊患者和正常对照者的临界值。对比cf-DNA和传统的血清标志物的敏感性和特异性，表明cf-DNA浓度与CEA联合检测对于结直肠癌早期诊断是一种有潜力的辅助诊断方法。研究结果显示将游离DNA浓度和CEA联合检测，能够在很大程度上提高结直肠癌的诊断率。这也是首次的研究发现，通过基于ALU序列的游离DNA定量方法与CEA联合检测提高结直肠癌的诊断效率。

因此，游离DNA作为一种新型的生物标志物，有望在将来单独或与其他肿瘤标志物联合应用于结直肠癌的辅助诊断及预后判断。然而，还需要更长的随访期和大规模的前瞻性研究，进一步验证血清游离DNA检测对结直肠癌患者的临床应用价值。

[1]Ferlay J，Shin HR，Bray F，et al.Estimates ofworldwide burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008［J］.Int JCancer，2010，127（12）：2893-2917.

[2]Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer JClin，2011，61（2）：69-90.

[3]Lawrie CH，Gal S，Dunlop HM，et al.Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma［J］.Br J Haematol，2008，141（5）：672-675.

[4]Mutch MG.Molecular profiling and risk stratification of adenocarcinoma of the colon［J］.J Surg Oncol，2007，96（8）：693-703.

[5]Keesee SK，Briggman JV，Thill G，et al.Utilization of nuclear matrix proteins for cancer diagnosis［J］.Crit Rev Eukaryot Gene Expr，1996，6（2/3）：189-214.

[6]Schwarzenbach H，Hoon DS，Pantel K.Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients［J］.Nat Rev Cancer，2011，11（6）：426-437.

[7]Pinzani P，Salvianti F，Zaccara S，et al.Circulating cell-free DNA in plasma ofmelanoma patients:Qualitative and quantitative considerations［J］.Clinica Chimica Acta，2011，412（23-24）：2141-2145.

[8]Wang BG，Huang HY，Chen YC ，et al.Increased plasma DNA integrity in cancer patients［J］.Cancer Res，2003，63（14）：3966-3968.

[9]Umetani N，Kim J，Hiramatsu S，et al.Increased integrity of free circulating DNA in sera of patients with colorectal or periampullary cancer:direct quantitative PCR for ALU repeats［J］.Clin Chem，2006，52（6）：1062-1069.

[10]Umetani N，Giuliano AE，Hiramatsu SH，et al.Prediction of breast tumor progression by integrity of free circulating DNA in serum［J］.Journal of Clinical Oncology，2006，24（26）：4270-4276.

[11]Cardelli M.Alu PCR［J］.Methods Mol Biol，2011，687:221-229.

[12]Qi J，Qian C，ShiW，et al.Alu-based cell-free DNA:a potential complementary biomarker for diagnosis of colorectal cancer［J］.Clin Biochem，2013，46（1/2）：64-69.