不同炮制方法对女贞子化学成分的影响

肖薇 黄健 陈志峰 郭桂明

摘要：目的 考察不同炮制方法对女贞子主要化学成分特女贞苷和齐墩果酸含量的影响。方法 用同一批次女贞子进行炮制加工，采用反相高效液相色谱法，对女贞子生品、酒制女贞子、醋制女贞子和盐制女贞子中的特女贞苷和齐墩果酸进行含量测定。结果 女贞子生品及3种不同炮制品中特女贞苷含量依次为盐制女贞子（1.997 5%）>女贞子生品（1.600 7%）>酒制女贞子（1.144 6%）>醋制女贞子（0.894 6%）。女贞子生品及3种不同炮制品中齐墩果酸含量依次为酒制女贞子（1.120 2%）>盐制女贞子（0.924 6%）>醋制女贞子（0.913 2%）>女贞子生品（0.899 8%）。结论 女贞子不同炮制方法对其特女贞苷和齐墩果酸的含量有一定影响。

关键词：女贞子；特女贞苷；齐墩果酸；炮制

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.023

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）07-0082-04

Effects of Different Methods of Preparation on the Contents of Chemical Components in Ligustri Lucidi Fructus XIAO Wei， HUANG Jan， CHEN Zhi-feng， GUO Gui-ming （Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100010， China）

Abstract：Objective To investigate the effects of different methods of preparation on the contents of nuzhenide and oleanolic acid in Ligustri Lucidi Fructus. Methods The same batch of Ligustri Lucidi Fructus was under preparation and process. RP-HPLC was used to determine the contents of nuzhenide and oleanolic acid in crude samples， wine-prepared samples， vinegar-prepared samples， and salt-prepared samples. Results The contents of nuzhenide were in the order as follow：salt-prepared samples （1.997 5%）>crude samples （1.600 7%）>wine-prepared samples （1.144 6%）>vinegar-prepared samples （0.894 6%）. The contents of oleanolic acid were in the order as follow：wine-prepared samples （1.120 2%）>salt-prepared samples （0.924 6%）>vinegar-prepared samples （0.913 2%）>crude samples （0.899 8%）. Conclusion Different methods of preparation have certain effects on the contents of nuzhenide and oleanolic acid in Ligustri Lucidi Fructus.

Key words：Ligustri Lucidi Fructus；nuzhenide；oleanolic acid；method of preparation

基金項目：首都医科大学附属北京中医医院院级课题（2013-26）

通讯作者：郭桂明，E-mail：ggmjq@sina.com

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（收稿日期：2014-12-10）

（修回日期：2015-01-05；编辑：陈静）

女贞子为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果实，性凉，味甘、苦，归肝、肾经，具有滋补肝肾、明目乌发的功效。女贞子历代炮制方法较多，如宋代有“饭上蒸”（《疮疡经验全书》），明代有用复合辅料酒、墨旱莲草及地黄制（《本草蒙筌》）、酒浸蒸晒（《本草通玄》）、酒拌黑豆蒸九次（《炮炙大法》）、酒拌蒸（《先醒斋广笔记》）、酒蜜拌蒸（《审视瑶函》）等方法，并有“浸酒去风补血”的论述（《本草品汇精要》），清代又增加了蜜酒拌蒸（《医方集解》）、盐水拌炒（《得配本草》）、白芥子车前水浸（《本草纲目拾遗》）等[1]。现代主要炮制方法以酒蒸和酒炖法应用居多[2]，不同炮制方法功效各异。

现代研究表明，女贞子主要含有萜类、黄酮类、苯乙醇苷类、挥发油、磷脂、多糖、脂肪酸、氨基酸、微量元素等化学成分，主要有保肝、免疫调节、抗动脉粥样硬化、抗炎、抗衰老等药理作用[3]，2010年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）以特女贞苷（C31H42O17）为质量控制指标[4]。2005年版《中国药典》以齐墩果酸为质量控制指标[5]。本研究采用高效液相色谱法（HPLC），比较醋制、酒制、盐制3种炮制方法对女贞子中特女贞苷和齐墩果酸含量的影响。

1 仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪（Agilent G1311A 四元泵，Agilent G1329A自动进样器，Agilent G1315D DAD检测器）；Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（5 μm， 150 mm×4.6 mm）；AL204型电子天平，METTLER TOLEDO；粉碎机RT-02B，台湾荣聪。

特女贞苷、齐墩果酸对照品购自中国食品药品检定研究院（供含量测定用，批号分别为111926- 201203、110709-201206），乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。女贞子样品（北京杏林药业有限责任公司，批号140217），经首都医科大学附属北京中医医院药学部主任药师郭桂明主任鉴定为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果实。

2 方法与结果

2.1 炮制方法

依据《北京市中药饮片炮制规范（2008年版）》[6]制备3种女贞子炮制品。醋制女贞子、酒制女贞子：称取100 g女贞子生品2份，分别放入陶瓷锅；精确量取20 mL米醋和20 mL黄酒，分别倾入2份女贞子样品中，拌匀，盖上锅盖，闷润3 h；保持陶瓷锅密闭，放入不锈钢蒸锅，蒸21 h。盐制女贞子：称取100 g女贞子生品1份，放入陶瓷锅；喷淋1%盐水20 mL，拌匀，闷润3 h；保持陶瓷锅密闭，放入不锈钢蒸锅，蒸1 h。

2.2 特女贞苷含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18 （150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（40∶60）；流速：1 mL/min；测定波长：224 nm；柱温为室温。理论板数按特女贞苷峰计算应不低于4000。

2.2.2 对照品溶液的制备 取特女贞苷对照品10.45 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得1.007 4 mg/mL对照品储备液（以96.4%计）。精密吸取对照品储备液2.5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得0.251 9 mg/mL对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取药材粉末约0.5 g（过3号篩），精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.2.4 线性关系考察 取特女贞苷对照品13 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶液并稀释至刻度，摇匀，得到0.250 6 mg/mL对照品储备液（以96.4%计）。精密吸取对照品储备液1、2、3、5、8、10、20 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样，测定峰面积。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，制备标准曲线，得回归方程为Y=1127.2X+69.56（r2=0.999 7）。结果表明，特女贞苷在0.250 6～5.012 μg范围内呈良好线性关系。

2.2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，连续进样6次，测定峰面积，RSD=0.67%（n=6），表明精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取同一供試品溶液，分别于0、4、8、12、16、24 h测定峰面积，RSD=1.02%（n=6）。结果表明，本品溶液在24 h内稳定。

2.2.7 重复性试验 精密称取同一样品6份，分别按“2.2.3”项下方法制成供试品溶液，测定含量。测得平均含量为0.899 6%，RSD=0.28%（n=6）。结果表明，方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 精密称取5份已测含量（0.899 6%）的醋制女贞子粉0.1 g，加入0.250 6 mg/mL对照品储备液4 mL，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，进样10 μL，测定特女贞苷含量，分别计算回收率。结果特女贞苷平均回收率为100.52%，RSD=1.70% （n=5），见表1。

2.2.9 样品测定 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件测定，对照品平均峰面积为1631.47，样品含量按干燥品计算，结果见图1、表2。

表1 醋制女贞子中特女贞苷加样回收率试验（n=5）

取样量

（g） 样品中

含量（mg） 加入量

（mg） 测得量

（mg） 回收率

（%） 平均回收

率（%） RSD

（%）

0.102 5 0.922 3 1.002 4 1.949 9 102.51

0.099 8 0.897 9 1.002 4 1.906 3 100.60

0.098 9 0.890 3 1.002 4 1.875 7 98.30 100.52 1.70

0.101 3 0.911 7 1.002 4 1.931 8 101.77

0.097 3 0.897 1 1.002 4 1.893 7 99.42

对照品 女贞子生品

醋制女贞子 酒制女贞子

盐制女贞子

图1 特女贞子含量测定HPLC图

表2 特女贞苷含量测定结果（n=4）

样品 取样量（g） 对照品峰面积 样品平均峰面积 含量（%）

女贞子生品 0.499 6 1631.47 2071.72 1.600 7

醋制女贞子 0.503 1 1631.47 1165.98 0.894 6

酒制女贞子 0.500 6 1631.47 1484.47 1.144 6

盐制女贞子 0.501 4 1631.47 2594.61 1.997 5

2.3 齐墩果酸含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18 （150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵溶液（67∶12∶21）；流速：1 mL/min；测定波长：210 nm；柱温为室温。理论板数按齐墩果酸峰计算应不低于5000。

2.3.2 对照品溶液的制备 取齐墩果酸对照品20.2 mg，置20 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得0.958 5 mg/mL对照品储备液（以94.90%计）。精密吸取对照品储备液1 mL，置20 mL量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，得到47.92 μg/mL对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备 取本品粗粉约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇50 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）30 min，放冷，再超声处理（功率250 W，频率50 kHz）30 min，放冷，称定质量，加乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.3.4 线性关系考察 精密吸取对照品储备液（0.958 5 mg/mL）0.2、0.5、1、5、10、20 μL，按“2.3.1”项下色谱条件进样，测定峰面积。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，制备标准曲线，得回归方程为Y=691.2X-45.791（r2=0.999 8，n=6）。结果表明，齐墩果酸进样量在0.202～2.02 μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.3.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，连续进样6次，测得峰面积，RSD=1.41%（n=6），表明精密度良好。

2.3.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、4、8、12、16、24 h测定峰面积，RSD=1.62%（n=5）。结果表明，本品溶液在24 h内稳定。

2.3.7 重复性试验 精密称取同一样品6份，分别按“2.3.3”项下方法制成供试品溶液，测定含量，平均含量为0.967 7%，RSD=1.30%（n=5）。结果表明，方法重复性良好。

2.3.8 加样回收率试验 精密称取5份已测含量（0.967 7%）的醋制女贞子粉0.1 g，加入0.958 5 mg/mL对照品储备液1 mL，按“2.3.3”项下方法制成供试品溶液，进样10 μL，测定齐墩果酸的含量，分别计算回收率。结果特女贞苷的平均回收率为100.37%，RSD=1.16%（n=5），见表3。

表3 醋制女贞子中齐墩果酸加样回收率试验结果（n=5）

取样量

（g） 样品中

含量（mg） 加入量

（mg） 测得量

（mg） 回收率

（%） 平均回收

率（%） RSD

（%）

0.100 4 0.971 6 0.958 5 1.945 0 100.77

0.101 7 0.984 2 0.958 5 1.976 9 101.76

0.099 3 0.960 9 0.958 5 1.920 0 100.03 100.37 1.16

0.098 9 0.957 0 0.958 5 1.888 7 98.60

0.101 2 0.979 3 0.958 5 1.951 2 100.69

2.3.9 样品测定 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按“2.3.1”项下色谱条件测定，对照品平均峰面积为332.28，样品含量按干燥品计算，结果见图2、表4。

对照品 女贞子生品

醋制女贞子 盐制女贞子

酒制女贞子

图2 齐墩果酸含量测定HPLC图

表4 齐墩果酸含量测定结果（n=4）

样品 取样量（g） 对照品峰面积 样品平均峰面积 含量（%）

女贞子生品 1.003 4 332.28 1252.13 0.899 8

醋制女贞子 1.021 2 332.28 1293.32 0.913 2

酒制女贞子 1.001 9 332.28 1556.42 1.120 2

盐制女贞子 1.182 3 332.28 1516.03 0.924 6

3 讨论

本研究选用女贞子药材中萜类水溶性成分特女贞苷和萜类脂溶性成分齐墩果酸作为指标成分。特女贞苷为2010年版《中国药典》（一部）女贞子含量测定的特异性指标成分。齐墩果酸为女贞子的主要有效成分，具有保肝、强心、降脂、降血糖、抗炎等药理作用，近年对其研究较为深入和广泛[3]。

特女贞苷的含量测定参照2010年版《中国药典》（一部）方法[4]，测定结果为盐制女贞子（1.997 5%）>女贞子生品（1.600 7%）>酒制女贞子（1.144 6%）>醋制女贞子（0.894 6%）。分析其原因，酒制、醋制的炮制方法加热时间较长，而特女贞苷随着炖制时间的延长含量呈逐渐降低的趋势[7]，环烯醚萜苷类性质不稳定，加水、加热可使其水解生成次级苷红景天苷。盐制的炮制方法引药入肾经，盐制女贞子中特女贞苷含量较高是否与药物归经有关还需进一步研究。

齐墩果酸的含量测定参照2005年版《中国药典》（一部）[5]和文献[8-9]中齐墩果酸的测定方法和条件。流动相采用乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵溶液（67∶12∶21），其中加入适当的酸碱调节剂有助于齐墩果酸的分离[8]，但该流动相并未将齐墩果酸和熊果酸进行有效的基线分离。此外，齐墩果酸为三萜类脂溶性成分，所以女贞子酒制炮制品中齐墩果酸的含量明显高于其他炮制品及生品。

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（收稿日期：2014-11-05）

（修回日期：2015-02-06；编辑：陈静）