白粉病相关基因MLO在瓜菜类白粉病广谱抗性研究中的应用

程鸿 孔维萍

摘 要： MLO（mildew resistance locus O）被认为是研究植物广谱抗性的模式基因，它编码一种7TM跨膜蛋白，对白粉病菌具有负调控作用。野生或者人工突变获得的mlo基因，对白粉病具有广谱抗性，表明MLO在植物白粉病育种方面具有潜在的应用价值。就MLO的发现、结构定位、细胞学证据、突变抗病的机制等方面的研究现状及在瓜菜类作物广谱抗性材料创制中的应用进行了总结，并讨论了今后的研究重点。

关键词： 白粉病； MLO； 广谱抗性

Progress of MLO gene on broad-spectrum resistance to powdery mildew in cucurbits and vegetables

CHENG Hong， KONG Weiping

（Institute of Vegetable， Gansu Academy of Agricultural Science， Lanzhou 730070， China）

Abstract： MLO（mildew resistance locus O）is considered to be a model plant gene suitable for study broad-spectrum resistance，which encodes a transmembrane protein 7TM. It may play a negative regulatory role on powdery mildew，which indicated that it has potential applications in plant breeding for resistance to powdery mildew. This paper depicts progress in powdery mildew research and creation of broad-spectrum resistance material in cucurbits and vegetables. The research direction in the future is also put forward.

Key words： Powdery mildew； MLO； Broad-spectrum

白粉病在我国分布较为普遍，危害很多农作物，为高度专化性寄生真菌，可侵染600多种植物[1]。它的主要寄主不仅包括麦类作物，而且还包括了众多的园艺类作物，在瓜类上发病尤为严重[2]。近年来随着分子生物学技术的逐步发展，人们开始重视利用分子育种技术从作物资源中挖掘抗白粉病种质资源，为品种选育提供支持，在黄瓜、西瓜、甜瓜等很多作物上也相继发现了抗白粉病基因[3]，这些基因资源极大地促进了瓜类种质资源的抗性育种创新。在我国由于地域广阔、生态环境复杂，白粉病不仅分布广泛而且生理小种众多。在黄瓜、冬瓜、南瓜、甜瓜等作物上均发现白粉病的生理小种[3-9]。从世界范围看这些生理小种也在逐渐演替，比如在美国东南部地区，瓜类作物上曾发现Podosphaera. xanthii族群的生理小种2向生理小种1演替[10]，在法国、西班牙、日本也有甜瓜白粉病生理小种演替的报道[10-11]。Hosoya等[12]提出为了应对不断演替的白粉病生理小种对品种抗性的挑战，育种者需要挖掘或者创新具有广谱抗性的种质资源，从而保持品种对白粉病菌的持续抗性。

MLO被认为是研究植物广谱抗病性的最佳模式基因[13]，普遍认为它对白粉病菌具有负调控作用，类似于植物的“感病基因”。无论在双子叶植物拟南芥还是单子叶植物大麦上，都有科学证据证明MLO突变体对白粉病菌具有广谱抗性[14-15]，因此在农作物白粉病育种方面具有一定的应用价值。本文在现有研究基础上综述MLO基因在瓜菜类作物广谱抗性方面的最新研究进展，并讨论该研究领域的发展方向。

1 MLO基因的发现

植物存在两类基本抗性，一类是“基因对基因”式的高度专一的R基因抗性，第二类抗性方式即通过突变寄主植物自身的一个或者几个基因，来诱导对某一类或几类病原物的抗性，大麦mlo基因就属于这类基因[16]。1937年，德国人发现野生的2个大麦株系对白粉病菌所有已知的生理小种都具有很高的抗性[17]，造成这种现象的原因是由于MLO基因发生了突变。研究发现通过人工诱导使大麦MLO基因突变可以使大麦产生对白粉病菌持久、广谱的抗性。一般认为MLO基因在植物的抗病过程起负调控的作用，在一定程度上相当于植物的“感病基因”，它缺失或突变后可能启动类似非寄主的识别反应，进而激发植物增加对病原菌的广谱抗性[13-14，18]，可见MLO基因在改善植物抗性方面具有较好的应用前景。欧洲的植物育种专家就利用理化诱变的方法获得了广谱抗白粉病菌的大麦品种，这类大麦mlo基因是目前唯一在生产上得到大规模利用的、而且也是最早获得的具有广谱抗性的基因[14]，包含有mlo基因的大麦品种能够高水平的抵抗30多个大麦白粉病菌生理小种，反应型为免疫或者近免疫[19]。虽然在欧洲大多采用粗放的管理栽培模式，但是这种抗病性在田间可以长久保持，它们几乎对绝大多数已知的大麦白粉病菌的生理小种具有抗性，且抗性水平高[19]。

mlo基因介导的抗性与R基因相比明显不同，其最显著的特点就是能抗所有己知的白粉病病原菌生理小种，具有广谱抗病性。从来源来讲任何感病的野生型（MLO）都可以通过化学、物理或者生物诱变的方法获得mlo抗性。目前在生产上应用的mlo抗病等位基因除mlo-11是自发天然突变之外，其他的均来源于人工诱变[14，20-21]。

尽管有学者发现白粉病菌Race 1和HL3/4小种在mlo抗性的大麦上具有轻微的侵染性[22]，但MLO基因重要的学术理论价值和广阔的应用前景，促使许多专家学者利用遗传学、分子生物学方法对MLO基因以及其编码蛋白做了大量深入研究，为此类基因在抗白粉病育种工作中的广泛应用提供了重要理论基础[23]。目前已鉴定出86个编码植物MLO同源蛋白基因，包括：拟南芥（15）；水稻（12）；大麦（2）；小麦（3）；玉米（9）；甜瓜（3）番茄（1）；芜菁（1）；辣椒（1）；百脉根（1）；豌豆（1）；高粱（2）；葡萄（8）；毛果杨（6）；江南卷柏（1）；烟草（1）； 北美云杉（1）和琴叶拟南芥（8）[15，24-29]。

2 MLO基因及其编码的蛋白结构与细胞定位

第一个野生大麦MLO基因在1997年被克隆，为MLO功能研究奠定了良好基础。研究发现大麦MLO基因的产物为一个60 ku的跨膜蛋白[13]，具有7个跨膜螺旋区，可能位于质膜上[30]。其氨基端和羧基端分别位于胞外和胞内，羧基的长尾上具有酪氨酸激酶的活性位点和核定位序列（NLS）[13]。Hinze等[31]运用分子定位标记技术把MLO基因定位到大麦第4条染色体的长臂上，Devoto等[13]利用MLO-Lep融合蛋白技术和N-端糖基化突变扫描，发现大麦品种ingrid的MLO蛋白有一个羧基端长尾，同样具备7个跨膜螺旋结构，其羧基端长尾结构与动物的G-蛋白偶联受体（GCRP）类似，并凭借该受体结构定位于质膜上；其N-端位于膜外，C-端位于膜内，在靠近第7螺旋的C-端胞质尾有一钙调素结合区域。平均而言，植物MLO家族成员之间相似性大约有70%，同源性大约有45%。蛋白序列平均60% 位于胞质内，25% 位于质膜上，15% 位于胞外。另外，MLO家族成员差异主要体现在只有C-端、N-端以及胞外第1环区域的序列长度上[13，32]。目前，MLO基因只在植物和苔鲜类中被发现，而酵母、原核生物和动物中均未发现有存在，说明MLO基因是植物所特有的[14-15，30]。

最近的研究发现受到病原菌侵染后，瞬时表达的MLO蛋白会在大麦的细胞质膜上重新分布，并且逐渐汇聚在白粉病菌的侵染钉下方[33]。Shirasu等[34]在具有广谱抗性的mlo大麦表皮细胞中瞬时表达MLO-GFP融合蛋白，在整个表皮细胞中均观察到荧光。Bhat等[33]认为在没有病原菌入侵时，大多数的MLO-YFP融合蛋白分布在表皮细胞的周围，另外在核膜和膜内也检测到了该蛋白；而当白粉病菌孢子被接种到叶面后，该融合蛋白就很快聚集到附着胞下方了。Cheng 等[35]在甜瓜上通过构建CmMLO2-GFP融合蛋白，在洋葱表皮瞬时表达甜瓜MLO蛋白，荧光显示融合蛋白定位在细胞膜上。

植物表皮细胞一旦受到白粉病菌入侵，MLO蛋白就开始向侵染点附近汇集，这一行为似乎不依赖于肌动蛋白细胞骨架功能。在白粉病菌成功入侵的侵染点周围，MLO蛋白/CAM大量增加。目前有关MLO蛋白的结构和定位虽然取得了一些共识，但是人们对MLO蛋白在植物细胞中的动态分布还不是十分了解，因此在单细胞和超微结构水平上系统分析病原菌侵染过程中MLO基因的时空表达特征，将有助于我们深入了解植物广谱抗病的机制。

3 MLO基因突变抗病的细胞学证据

野生型MLO基因和一般意义上的R基因有所不同，它转录表达后让大麦对白粉病菌开始感病，而当其突变为隐性mlo基因时，该突变体对白粉病菌又表现出非小种专化抗性，在机制上表现为植物的表皮细胞壁迅速加厚从而形成坚硬的乳突结构并产生新的抑菌化学组分，提升了白粉病菌入侵细胞的门槛[36]，从而抵制病原菌的初侵染。人们对大麦的乳突抗病机制的细胞学研究发现，乳突反应（papilla response）是其遭到白粉菌侵染时产生的一种典型的非专化型防卫反应。乳突指通过乳突反应在入侵位点沉积在细胞壁与原生质膜之间的半球状体。乳突的形成是病菌能否成功侵染的关键，因此，认为乳突具有物化的抑制病菌入侵的作用，即乳突抗性。能够广谱高效的抵御白粉病菌的大麦mlo突变品种的特征之一，就是形成乳突[37-38]，对于mlo 突变基因的大麦品种而言，快速、高频率的形成乳突是抗初侵入的关键因素[39]。

早期认为大麦乳突抗性主要表现在抗机械入侵，附着胞入侵时能产生机械压力，但实际上有关乳突物理特性的研究非常有限。Kunoh[40]认为乳突硬且有一定弹性，含有较高浓度硅，所以可以抵抗一定的机械压力，只有500 u的分子才能自由出入乳突。由于大多数病原菌激发子分子量均在1 ku以上，因此它可以在一定程度上阻止寄主与病原之间的信息交流。由此可见，在乳突物理特性方面，它至少有机械抵抗和不通透性2种潜在抗病作用。最近研究发现，MLO蛋白通过抑制抗真菌基因（avrMla）的防御反应，在真菌侵染点产生有这些组分引导的病原物诱导的分子抗病模型（PAMPs）[41]。

通过荧光漂白恢复技术（FRAP）检测表明该类蛋白的极化作用是非连续性的，只是植物在受到白粉病菌侵染后的一次应激反应。将标记红色荧光的过氧化物酶体HVADF3肌动蛋白分解聚积因子HVADF3能阻止肌动蛋白的转运途径和标记黄色荧光蛋白的MLO一起转入大麦表皮细胞。观察发现，大部分观测的细胞在侵入位点除了聚积的过氧物化酶体外，仍然有大量蛋白聚积，表明有白粉病菌入侵引发的MLO蛋白的聚积并不通过肌动蛋白丝介导的转运途径，而是来自于周围的膜蛋白，并很早就聚集在植物表皮细胞的质膜上[33]。

4 突变体mlo在白粉病广谱抗性中可能的作用机制

一直以来细胞过敏性坏死被认为是植物抗病性表现的主要作用机制，因此野生MLO基因可能对细胞坏死具有负向调控作用，也就是对细胞坏死起抑制作用[33，32，42]；类似于其他突变体基因以寄主死亡来抵抗病原菌的入侵，MLO基因突变为mlo基因后，对细胞坏死的负调控作用被解除，由此引发了植物的广谱抗性[30，32，34，42]。也有证据表明，具有mlo突变的大麦能够抑制病原菌吸器的形成，但被侵染的表皮细胞并未立即坏死。

Panstruga[14]在2005年提出了大麦MLO与白粉病菌相互作用的假说，白粉病菌萌发长出芽管，附着在表皮细胞上，病原相关的分子模式PAMP引发信号传导，大麦获得性免疫系统被激发，从而启动了一系列的生化免疫反应，防卫相关基因开始转录，MLO在相应的生物胁迫位点聚集，在细胞外围MLO调控ROR2介导的抑制防御体制开始形成。MLO开始大量转录，胞吐作用（exocytosis）的调控因子汇集，促进了附着孢的生长。Bhat等[33]认为在大麦表皮细胞中首先出现膜蛋白极化现象，然后白粉病分生孢子才长出初生芽管。MLO相关蛋白在两极的高固醇区域聚集，接着孢子芽管继续生长，在附着胞和附着胞芽管的下方集中了大量的类高固醇物质，说明膜蛋白位于真菌侵入点的最前沿。

Shirasu等[34]用基因枪转化方法将MLO基因转化到具有mlo突变体基因背景大麦表皮细胞中，发现白粉病菌成功侵染了那些能表达绿色荧光蛋白的细胞，恢复了表皮细胞对白粉病的易感性。另外，Kim等[43]利用瞬时表达系统将野生型MLO基因导入MLO大麦叶片，发现使其感病性近乎100%；而用突变型mlo基因轰击MLO大麦叶片，其感病性没有变化，表明MLO基因是感白粉病所必需的。Schweizer等[44]利用RNAi技术，将MLO-dsRNA直接导入具有野生型MLO背景的大麦表皮细胞，结果使得平均白粉菌侵染率降低了50%。试验表明MLO基因在接菌的3 h内被大量诱导，在那些成功导入的细胞内MLO基因的mRNA被大量降解，不能合成正常功能的MLO蛋白，解除了对细胞死亡的负调控作用，同时该细胞获得具有类似于MLO隐性或突变体植株的白粉病抗性，表明MLO基因和mlo基因具有功能上的互补性[31，30，44]。通过比较非寄主抗性和mlo免疫的大麦和拟南芥的组织学和病理学特征，结合白粉病发病的必备条件，显然2种抗性具有很多共性特点，Humphry等[45]推测这2种抗性的机制可能是一样的，他说这就像同一枚硬币的两个面，可见2种抗性之间没有本质的区别。在mlo突变体中，由于关键的入侵蛋白MLO的缺失，病菌入侵将面临严重障碍。这就是为什么mlo具有广谱和持久抗性的原因。所以，任何影响非寄主抗性的基因突变同样可能影响mlo免疫。

5 问题与展望

MLO基因和已经克隆的任何R基因都没有同源关系，是新型感病类基因，它的基因产物是细胞死亡和植物抗性的负调控因子，携带mlo突变的大麦在没有病原菌存在时易引发自发性的细胞坏死[46]。MLO被诱变导致基因缺失或移码突变成为mlo后，不能合成有正常功能的MLO蛋白，因此对细胞死亡的负调控作用被解除，叶表皮细胞将积累一些抗真菌活性的酚类物质以及H2O2和O2-，H2O2可能直接杀死病原菌和被侵染细胞，从而加固了细胞壁，防止了白粉病的侵染[20]，由此引发广谱的抗病性。目前人们对MLO蛋白作用机制的了解还非常有限，自发性的细胞坏死假说也不能完全解析mlo对白粉菌抗性的广谱和持久抗性机能。但不管怎样MLO植物突变为mlo之后，表皮细胞壁明显快速形成了大量坚固的乳突（Papillae），提高了白粉病菌入侵的门槛，抑制了初生菌丝的发育、次生菌丝和次生吸器的形成，降低了入侵率[23]。

在过去的很多年里，植物病理学家和植物育种家都认为，mlo的广谱抗性似乎是单子叶植物大麦所独有的[14]，随着拟南芥基因组测序工作的完成，人们期待能够在双子叶植物中找到类似大麦MLO基因的愿望变成了现实。在最近的拟南芥MLO基因的研究中，科研人员发现野生型拟南芥具有15个MLO家族成员[47]，其中的AtMLO2、AtMLO6和 AtMLO12三突变体可以使拟南芥对白粉病菌（Golovinomyces and G. orontii）完全免疫[15]。这一重要的研究结果表明：mlo的广谱抗性并不是大麦等单子叶植物所独有的，在拟南芥等双子叶植物中也存在MLO基因对白粉病的负调控机制。越来越多的研究结果表明：MLO基因转录缺失或编码的cDNA序列的突变均可能导致多肽序列的改变，从而引起白粉病的抗性转换。Bai等[2]在对白粉病抗性的野生型番茄R26品系中的研究发现，SlMlo1 cDNA序列有19个碱基的缺失，这个序列改变导致SlMlo1在编码区移码，猜测导致过早的翻译终止，从而也导致了番茄R26对白粉病的广谱抗性。甜瓜作为白粉病菌的广泛寄主，很有可能存在对细胞死亡负调控的类似机制，基于这种猜想，笔者通过同源克隆的方法，从感病的甜瓜中克隆分离了3个MLO家族基因，分别命名为CmMLO1、CmMLO2、CmMLO3。将其与绿色荧光蛋白（GFP）构建融合基因，进行细胞定位研究，并通过real-time PCR定量分析白粉病发病进程中各家族基因的mRNA水平变化，鉴定出参与白粉病调控的主效基因是CmMLO2，同时选择高效RNA干扰载体转化甜瓜，抑制了内源MLO基因的表达，获得了具有广谱和持久的甜瓜白粉菌抗性种质[24，35，48]。徐坚等[49]以黄瓜、甜瓜和西瓜基因组数据为基础，利用生物信息学方法对其MLO基因家族进行鉴定与分析。发现黄瓜、甜瓜和西瓜基因组中共含有42个MLO基因家族成员，每个物种均含有14个成员，且保守性强。这一研究结果为揭示黄瓜、甜瓜和西瓜MLO基因的进化关系、功能及克隆表达分析奠定了基础。

随着分子生物学、植物病理学和基因工程技术的迅猛发展，应用基因工程手段创新种质、提高植物的抗病性为抗病育种开辟了一条新途径。在瓜类作物上，白粉病的寄主范围广泛，甜瓜、黄瓜、南瓜、西瓜等大部分葫芦科作物都有不同程度的感染。因此开展具有广谱抗性的MLO基因研究，对于创制广谱抗性的种质资源，提高作物抗病育种水平具有重要意义。

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