抗炎抗风湿功效中成药中非法添加非甾体抗炎药及激素类成分的检测

汪元符

（南昌市食品药品检验所，江西 南昌 330038）

抗炎抗风湿功效中成药中非法添加非甾体抗炎药及激素类成分的检测

汪元符

（南昌市食品药品检验所，江西 南昌 330038）

目的：针对抗炎抗风湿功效类中成药，建立可能非法添加的对乙酰氨基酚等10种非甾体抗炎药成分及地塞米松等3种糖皮质激素成分的高效液相色谱-质谱联用的检测方法。方法：色谱柱为PHenomenex Luna C18（2）100A（150 mm×2.00 mm，3 μm）；柱温为40℃；流动相为10 mmol/L甲酸铵（以甲酸调节pH值至3.0）及乙腈，梯度洗脱；流速为0.2 mL/min；以优化后的质谱参数采集信号。结果：各成分检出限浓度为0.1～2 ng/mL；定量限浓度为0.5～ 5 ng/mL；线性范围为各成分定量限～100 ng/mL；在线性范围内相关系数均在0.99以上；平均加样回收率为93.0%～ 102.7%。结论：本方法简便，快速，准确，灵敏度高，专属性好；能用于抗炎抗风湿功效类中成药中非法添加的快速检测。

高效液相色谱-质谱联用；抗炎抗风湿功效类中成药；非甾体抗炎药；糖皮质激素

在食品药品监督管理部门日常的监督抽检、风险监测及投诉举报受理的工作中，抗炎抗风湿功效类中成药非法添加非甾体抗炎药及激素的情况时有发生，严重危害着人民群众的用药安全。现行法规标准在检测此类非法添加时，方法繁琐，需经3个不同色谱系统。基于提高工作效率，增加非法添加可筛查成分，提高检测方法的灵敏度、准确度、精确度的原因，本实验室建立了以下有效的高效液相色谱-质谱联用法，以一种色谱系统，电喷雾离子源正、负离子同时监测，可同时检测多种非甾体抗炎药及激素，能够满足平时的监督检验需要。

1 仪器、试剂与材料

AB Sciex 4000 Qtrap质谱，ekspert ultraLC100高效液相色谱仪，METTLER TOLEDO ME204E电子分析天平，METTLER TOLEDO XS105电子分析天平，昆山KQ-300DB型数控超声波清洗器，TG16-WS台式高速离心机（湘仪离心机），Millipore超纯水系统。

甲醇（色谱纯，Merck），乙腈（色谱纯，Merck），甲酸（色谱纯，天津科密欧），甲酸铵（色谱纯，武汉伟琪博星）。

对照品：对乙酰氨基酚（100018-200408）、布洛芬（100179-201105）、萘普生（100198-201205）、氨基比林（100503-200301）、甲氧苄啶（100031-200304）、双氯芬酸钠（100334-200302）、尼美舒利（100555-200501）、保泰松（100481-200601）、吡罗昔康（100177-200603）、吲哚美辛（100258-200904）、氢化可的松（100152-200206）、地塞米松（100129-201105）、醋酸泼尼松（100012-200706），均为中国食品药品检定研究院提供。

样品：购自流通企业或医疗机构。舒筋健腰丸（规格：45 g/瓶，批号：130701），追风透骨丸（规格：36 g/瓶，批号：131102），木瓜丸（规格：0.18 g× 240丸 /瓶，批号：140722），活络消痛片（规格：0.35 g/片，批号：140301），复方夏天无片（规格：0.3 g/片，批号：140710），尪痹片（规格：0.5 g/片，批号：140302），腰息痛胶囊（规格：0.3 g/粒，批号：141016），野木瓜胶囊（规格：0.45 g/粒，批号：131207），痹祺胶囊（规格：0.3 g/粒，批号：131015），祛风止痛胶囊（规格：0.3 g/粒，批号：140105）。

2 方法与结果

2.1 高效液相色谱分析条件

分析柱：PHenomenexLunaC18（2）100A（150 mm× 2.00 mm，3 μm）；柱温：40℃；流速：0.2 mL/min；进样量：5 μL；流动相：A为10 mmol/L甲酸铵（以甲酸调节pH值至3.0），B为乙腈。按表1进行梯度洗脱。

表1 梯度洗脱程序

2.2 质谱分析条件

电喷雾离子源（ESI）：正离子模式（ESI+）、负离子模式（ESI-）；扫描模式：MRM；扫描范围：50～600 Da；Curtain Gas（CUR）：25；Collision Gas（CAD）：Medium。IonSpray Vottage（IS）：正5 500，负4 500；Temperature（TEM）：500；Ion Source Gas1（GS1）：55；Ion Source Gas2（GS2）：50；Interface Heater（ihe）：on。离子对选择（MRM Ion Pairs）见表2。

2.3 对照品溶液的配制

取对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生、氨基比林、甲氧苄啶、双氯芬酸钠、尼美舒利、保泰松、吡罗昔康、吲哚美辛、氢化可的松、地塞米松、醋酸泼尼松对照品各约10 mg，精密称定，以甲醇制成每1 mL中各含 1 mg的溶液作为对照品储备液。精密量取对照品储备溶液 1 mL，以 50%甲醇，制成各含200 ng/mL的溶液，作为对照品储备液。对照品储备液以50%甲醇等比稀释，可得到各含 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，100.0 ng/mL的标准系列溶液。

表2 质谱分析

2.4 供试品溶液的配制

将10批分别为丸剂、片剂、胶囊剂（取内容物）的样品研细，各取约 0.50 g，精密称定，置100 mL量瓶中，加入50%甲醇约80 mL，超声处理20 min，放冷至室温，以 50%甲醇定容，摇匀，以 10 000 r/min离心 10 min后，取上清液，以50%甲醇溶液稀释10～ 100倍，用0.2 μm的滤头滤过，取续滤液测定。

2.5 对照品定量离子对（50 ng/mL）提取质谱图

见图1～13。

2.6 定性确认

图1 甲氧苄啶：292.1/231.1提取质谱图注：ESI+，tR为1.69 min

图2 对乙酰氨基酚：152.1/110.3提取质谱图注：ESI+，tR为3.05 min

采用保留时间与对照品相一致，且定性与定量离子对相对离子丰度比应满足表3要求，判为检出。

图3 氨基比林：232.0/113.3提取质谱图注：ESI+，tR为3.73 min

图4 氢化可的松：363.2/121.3提取质谱图注：ESI+，tR为10.45 min

图5 地塞米松：391.3/361.3提取质谱图注：ESI-，tR为11.11 min

图6 吡罗昔康：329.9/146.1提取质谱图注：ESI-，tR为11.57 min

图7 醋酸泼尼松：399.2/339.3提取质谱图注：ESI-，tR为11.92 min

图8 萘普生：228.9/169.8提取质谱图注：ESI-，tR为12.27 min

图9 尼美舒利：308.0/229.9提取质谱图注：ESI-，tR为13.09 min

图10 吲哚美辛：356.2/312.1提取质谱图注：ESI-，tR为14.12 min

图11 双氯芬酸钠：294.0/250.0提取质谱图注：ESI-，tR为14.15 min

图12 布洛芬：205.1/160.9提取质谱图注：ESI-，tR为14.85 min

各对照品试验结果如表4所示。

图13 保泰松：308.2/280.0提取质谱图注：ESI-，tR为15.30 min

表3 定性与定量离子对相对离子丰度比 （%）

表4 对照品试验结果

2.7 线性关系及检出限、定量限考察

采用“2.1”项下的色谱条件，“2.2”项下的质谱条件，以“2.3”项下的标准系列溶液进样检测。以检测所得峰面积为纵坐标，以标准系列溶液浓度（ng/mL）为横坐标，进行线性拟合。以定性离子对和定量离子对提取的质谱图信噪比均大于3时的浓度（ng/mL）为检出限。以定性离子对提取的质谱图信噪比大于3，定量离子对提取的质谱图信噪比大于10时的浓度（ng/mL）为定量限。以在一定浓度范围内，相关系数大于 0.99，为线性范围。结果表5。

2.8 精密度试验

选用标准系列溶液中各成分浓度为10.0 ng/mL的标准溶液，连续进样6针，以提取的定量离子对质谱图峰面积计算。结果见表6，各组分RSD值均在0.32%～ 0.84%之间。

表5 线性关系及检出限、定量限考察结果

表6 精密度试验结果

2.9 稳定性试验

选用标准系列溶液中各成分浓度为10.0 ng/mL的标准溶液，在0，1，2，4，8，12，24 h分别进样，以提取的定量离子对质谱图峰面积计算。结果如表7，各组分RSD值均在0.79%～ 1.58%之间。

表7 稳定性试验结果

2.10 回收率试验

取丸剂（舒筋健腰丸）、片剂（活络消痛片）、胶囊剂（腰息痛胶囊）各1份，如“2.4”项下平行称样各3份，分别加入50，200，500 μL每1 mL中各含1 mg的对照品储备液，置 100 mL量瓶中，加入50%甲醇约 80 mL，超声处理 20 min，放冷至室温，以50%甲醇定容，摇匀，以10 000 r/min离心10 min后，取上清液，以 50%甲醇溶液稀释 100倍，用0.2 μm的滤头滤过，取续滤液测定。则丸剂、片剂、胶囊剂的3份平行样最终加标浓度分别为5，20，50 ng/mL。以5次平行测定结果的均值与加标浓度相比较，回收率结果见表8，不同剂型各组分高、中、低3个浓度的回收率均在93.0%～102.7%之间。

2.11 样品测定结果

检测了10批抗炎抗风湿中成药，结果均为阴性。

3 讨论

3.1 流动相的选择

试用了不同种类、比例、pH值的流动相，如：水-甲醇、水-乙腈、0.2%甲酸水-甲醇、0.2%甲酸水-乙腈、10 mmol/L甲酸铵-乙腈、10 mmol/L乙酸铵-乙腈、10 mmol/L乙酸铵-乙腈-四氢呋喃。试用了不同梯度洗脱方式。以本法所选用的流动相：A（10 mmol/L甲酸铵以甲酸调节pH值至3.0）-B（乙腈）采用的洗脱方式，13种成分检测灵敏度均能达到满意。

3.2 质谱条件的优化

13种成分均同时采用ESI+及ESI-检测，根据试验结果，选用灵敏度高的一种方法。选用灵敏度最高的一组离子对作为定量离子对，再选择灵敏度次高的一组离子对作为定性离子对。

3.3 供试品提取方法选择

试验表明，以甲醇或50%甲醇超声提取，没有明显区别，考虑到溶液强度及在色谱中的扩散，采用50%甲醇比较有利；超声15 min即可有效提取所测组分，采用20 min较稳妥。

表8 回收率试验结果

参考文献：

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（收稿日期：2015-06-16）

Detection of Non-steroidal Anti-inflammatory Drug and Glucocorticoid Added Illegally in Anti-inflammatory and Antirheumatic Traditional Chinese Medicine

Wang Yuanfu （Nanchang Institute for Food and Drug Control，Jiangxi Nanchang 330038，China）

Objective：To establish a HPLC-MS/MS method for the detection of acetaminophen，dexamethasone and other 10 kinds of non-steroidal anti-inflammatory drugs and 3 kinds of glucocorticoid in anti-inflammatory and antirheumatic traditional Chinese medicines.Methods：PHenomenex Luna C18（2）100A column（150 mm×2.00 mm，3 μm）was used，the column temperature was at 40℃，the mobile phase was 10 mmol/L ammonium formate（pH 3.0）-acetonitrile，using gradient elution method，the flow rate was 0.2 mL/min and optimization MS/MS method was adopted.Results：The detection limit of this method was 0.1～ 2 ng/mL，the limit of quantitation was 0.5～5 ng/mL and the linear range was the limit of quantitation～ 100 ng/mL.The test results showed the related coefficient in the linear range was more than 0.99.The average recovery of the method was 93.0% ～ 102.7%. Conclusion：This method is simple，rapid and accurate with a high sensitivity and specificity.It can be used for the quick detection of illegally added materials in anti-inflammatory and antirheumatic traditional Chinese medicines.

HPLC-MS/MS；Anti-inflammatory and Antirheumatic Traditional Chinese Medicines；Non-steroidal Anti-inflammatory Drug；Glucocorticoid

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.11.005

2015-06-28）

表5 两组患者的疗效比较

注：治疗组与对照组比较P=0.036 1

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3 讨论

汪元符，男，主管药师。研究方向：中药理论、药物检测及食品安全。E-mail：wanngel@126.com

目前，国内的中医药治疗糖尿病足依然缺乏统一标准、统一操作规程以及缺乏截肢率、溃疡的发生率、医疗费用等大样本流行病学资料支持中医药治疗糖尿病足的效果分析。本实验以中药药敏的方法研究黄连液最佳使用浓度和麝香的最佳使用剂量，可以作为解决中医药对糖尿病足治疗在药物选择、剂量确定缺乏统一标准现状下的方法之一。通过本实验发现，黄连液联合麝香比原组方的抑菌作用明显增强，对于那些抗菌药物无效的多重耐药菌，黄连液和麝香能起到明显的杀菌和抑菌作用，中药将成为控制糖尿病足细菌感染的另一最佳的选择，为临床治疗糖尿病足提供了一种新的有效方法。