血清mi R-132和mi R-212表达在肝硬化检测中的意义

王永良

(龙门县人民医院，广东 龙门516800)

Selmi C最初发现原发性胆汁性肝硬化患者血清中miR-132和miR-212的表达均有变化，miR-132与miR-212在血清中的表达与免疫力相关[1]。故近5年多项研究均将miR-132与miR-212的靶向作用进行研究，miR-132已被确认为血管再生开关因子，miR-212已被确认为细胞有丝分裂开关因子。此二者对肝硬化的修复过程均具有现实意义[2，3]。肝硬化患者的miR-132和miR-212的表达均有降低，检测血清miR-132和miR-212对肝硬化的诊断具有积极意义。

表1 患者一般资料表

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2011年4月至2014年4月来我院参与肝硬化治疗的患者63例，其中男性42例，女性21例，年龄 32~67岁，平均年龄 45±1.2岁。所有患者均为龙门地区汉族人群。患者合并腹膜炎的33例，肠系膜炎32例，门静脉高压患者41例，淤血性脾大患者39例，腹水患者17例。全部患者有饮酒史，日均饮酒50ml以上的21例。所有患者中，代偿期肝硬化22例，失代偿期肝硬化患者41例。见表1。

1.2 标本采集方法 采用一次性真空采血管采集患者空腹静脉血5ml。置于离心机中，使用10000r/min转速离心10min。取上清液(血清)置于-80℃保存。

1.3 RNA提取方法 取样本血液1ml，置于离心机中10000r/min离心处理1.5min。取血清200μl加入200μlTrizol裂解剂，充分震荡，提取总RNA。

1.4 PCR反应及miRNA逆转录方法 提取的RNA溶解于 11 μl DEPC-treated water， 加入 1μl Oligo(dT)18 primer(0.5μg/μl) 轻微震荡后离心 3~5s，在PCR扩增仪上70℃5min。冰上冷却，并短暂离心，向反应体系中加入 5×reaction buffer 4μl，Ribolock-TMRibonuclease inhibitor(20U/μl)1μl，10 mM dNTP mix 2μl。轻微震荡后离心3~5s，在PCR扩增仪上37℃ 5min。向反应体系中加入 RevertAidTMMMuLV Reverse Transcriptase(200U/μl)1μl，在 PCR扩增仪上42℃ 60min，70℃ 10min。引物设计使用广州锐博公司的标准序列。退火温度为60℃，产物片段106bp，以U6标准作为内参考[4]。

1.5 生化分析方法 备份血液样品进行GGT、ALP、ALT及TBil等肝功能项目检测，使用生化分析仪及配套试剂完成[5-8]。所有操作均按说明书严格操作，因此操作过程与本文实质研究结果并无直接关系，在此不做赘述。

1.6 统计学方法 用SPSS 19.0统计软件进行。计量资料用x+s表示；多组间数据的比较采用单因素方差分析，多组数据两两间的比较采用 LSD-t检验，两变量之间关系采用 Pearson相关性分析;以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 生化及临床检测结果 在总胆红素(T Bil)、直接胆红素(D Bil)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)和γ-谷氨酰基转移酶(GGT)等指标中，研究组均与实验组具有明显差异，特别是代表肝脏损伤的ALP和GGT指标，研究组明显高于健康组。胆碱脂酶(CHE)C反应蛋白(CRP)血沉(ESR)两组患者基本相似。见表2。

表2 各组对象生化及临床指标对比表(±s)

表2 各组对象生化及临床指标对比表(±s)

参数 研究组 健康组 F P TBil(μmol/L)DBil(μmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)ALP(U/L)GGT(U/L)CHE(KU/L)CRP(mg/L)ESR(mm/h)46.4±13.8 24.9±9.8 66.3±12.7 81.2±26.7 332.1±123.5 102.9±18.9 6.8±4.1 4.1±2.1 14.2±8.9 16.6±5.3 4.3±2.6 30.7±4.6 36.2±6.2 77.3±16.5 23.4±7.8 7.3±4.0 4.6±1.6 13.7±7.8 8.7 10.6 9.8 8.8 22.2 36.4 4.8 5.3 5.1 0.012 0.001 0.003 0.031 0.029 0.017 0.124 0.063 0.057

2.2 miR-132和miR-212的表达水平 两组患者的miR-132和miR-212的表达水平均有所降低，特别是miR-132降低幅度较大。而部分患者的miR-212水平出现了升高，但此部分患者占肝硬化患者的一小部分。也就是说，肝硬化患者的miR-132和miR-212均出现了波动，miR-132以下降为主，下降幅度在50%以上，而miR-212除极少部分偏高外，绝大部分都出现了一定程度的下降。见表3。

表3 各组研究对象血清miR-132和miR-212的表达水平对比(x±s)

3 讨论

目前普遍认为miR-132是血管生长的刺激因子，miR-132升高时，血管的修复能力增加，毛细血管更加发育。而当miR-132下降时，机体的自我修复能力表现低迷，机体愈合能力降低。miR-132无疑为肌体特别是血管修复的“开关因子”。miR-212因子是刺激细胞分裂的因子，当miR-212因子升高时，细胞分裂更加活跃，而当miR-212因子降低时，细胞分裂活动比较缓慢。事实上，目前的癌症信息素治疗方案中，有效地抑制miR-132和miR-212因子，可以有效地调节癌症发生和恶化的概率。而肝硬化患者体内的miR-132降低抑制了肝脏的自我修复，而miR-212的波动，引起了肝脏内局部异常增生或者同步造成了肝脏的自我修复能力降低。

Selmi C等[1]对肝硬化的免疫功能改变进行了研究，特别研究了肝硬化患者手术康复期的免疫能力变化。肝硬化患者的免疫力在本文研究中出现了普遍下降，比非肝硬化组出现炎性症状的概率明显升高。Dai R等[9]研究了自身免疫对于源发胆汁肝硬化的病理作用。原发性胆汁性肝硬化是导致miR-212升高的主要原因，在原发性胆汁性肝硬化条件下，miR-132下降幅度更加明显，而miR-212更倾向于发生升高的变化。Murata K等[10]研究了风湿性关节炎和骨膜炎患者的miR-132和miR-212表达。miR-132与miR-212在风湿性关节炎和骨膜炎患者血清中的表达与肝硬化类似，此两类患者的miR-132和miR-212表达均出现了较明显的下降，且miR212降低的幅度大于肝硬化患者。Wei X等[11]研究了病毒性肝癌患者的miR-132和miR-212表达。本文研究同步发现，肝硬化患者的miR-132和miR-212表达会出现显著变化，miR212出现下降而miR-132在肝硬化体质的基础上出现升高。这与肝硬化患者的免疫力下降是同步的。

Heathcote EJ等[12]对肝脏疾病进行了统观性的研究。徐芸等及陈燕等对肝硬化患者的相关体征检查数据进行了汇总，并且做出了统观性研究[13，14]。 从某种意义上，miR-132 和 miR-212 表达是肝硬化患者的一个体质特征，本文虽然没有对miR-132和miR-212表达于肝硬化的形成产生明显的相关性结论，但足以证明miR-132和miR-212表达与肝硬化体质具有直接的关系。

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