东莞地区2 9 6 0例女性宫颈脱落细胞H P V基因分型结果分析

张七二，钟锦开 ，蒲荣 ，邝树华 ，王占科

(1、东莞市寮步医院，广东 东莞523400；2、南昌市解放军第九四医院，江西 南昌330002)

流行病学和基础研究已证实人乳头状瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)感染是宫颈上皮内瘤变和宫颈癌的主要病因，特别是持续的高危型HPV感染[1]。目前已发现的HPV亚型有100多种，其中40余种与生殖道疾病相关[2]，不同HPV亚型其致病性不同，且不同地区及不同年龄段女性，HPV分布及感染率亦存在差异，因而非常有必要对不同地区女性HPV感染状况进行流行病学检查，为制订适合本地区HPV感染防治工作提供理论依据。HPVDNA检测是从病因学角度进行宫颈病变的筛查，诊断方面具有检查快速、特异性高等特点[3]。本研究采用基因扩增及导流杂交技术对我院2960例女性患者宫颈脱落细胞中HPV21种亚型进行检测，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 病例来源 2014年1月至2014年8月来我院就诊女性患者2960例，年龄为16~81岁。

1.2 标本采集 由临床医师以窥阴器暴露宫颈，将宫颈刷置于宫颈口轻轻搓动宫颈刷，顺时针旋转5圈后慢慢取出，置于装有细胞保存液的取样管中，拧紧瓶盖及时送检，若不能马上检测者则应保存于4℃冰箱，长期保存者应置于-20℃低温冰箱中。

1.3 主要试剂与仪器 HPV-DNA检测试剂盒 (潮州凯普生物化学有限公司)，ABI-7500荧光定量PCR仪，HHM-2型凯普医用核酸分子快速杂交仪。

1.4 检测步骤

1.4.1 DNA提取 取含有宫颈脱落细胞的细胞混悬液0.5ml，14000r/min离心去上清液后，严格按照试剂说明书提取DNA。

1.4.2 PCR扩增 将1μlDNA模板加至0.75μlDNA Tag酶及23.25μlPCR Mix反应体系中，瞬间离心并上机扩增。PCR扩增条件为，95℃变性9min；95℃、20s，55℃、30s，72℃、30s循环 40 次；72℃延伸5min。

1.4.3 杂交及结果判读 严格按照试剂说明书操作，膜上出现清晰可见的蓝紫色圆点者为阳性，不同位点代表不同亚型，其中低危型有6、11、42、43、44，高危型有 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、Cp8304，另设阴、阳性对照。

1.5 统计学处理 所有数据均采用SPSS13.0软件进行统计学处理。

2 结果

2.1 HPV检测情况 2960例标本中共检测出20种HPV亚型，未检测到43亚型，830例标本阳性，阳性率为28.04%。

2.2 HPV多重感染情况 830份阳性标本中共检出1090株HPV病毒，单一HPV亚型感染654例，占78.80%，多重亚型感染176例，占21.20%(以二重、三重感染为主)，另见一例七重亚型感染者。感染前五位亚型分别为 16(17.16%)、52(15.23%)、58(12.30%)、Cp8304(7.16%)、11(6.15%)；其中低危型 129 例，占 14.54%，以11、6 亚型为主；高危型 701 例，占 84.46%，以 16、52、58亚型为主，具体结果见表1、表2。

表1 830份HPV阳性标本中HPV亚型分布情况(%)

表2 HPV亚型多重感染情况

2.3 不同年龄段HPV感染情况 不同年龄段HPV检出率存在差异性，其中21~30岁、>50岁阳性检出率分别为38%、33%，明显高于28.04%平均水平(χ2=6.02 和 χ2=5.43，P<0.01)，具体结果见表 3。

表3 不同年龄段HPV感染情况

3 讨论

宫颈癌在全球妇女恶性肿瘤中居第2位，仅次于乳腺癌，是威胁妇女健康的重要疾病。且其发病有年轻化趋势。早期诊断和治疗宫颈上皮内瘤变是降低宫颈癌发病率和死亡率的关键。人们正在努力寻找与肿瘤生物学行为关系更密切、更客观、可重复性好的指标[4]。

HPV是一类具有严格宿主范围和组织特点特异性病毒，主要通过性传播，低危型主要引起尖锐湿疣等症状，而高危型则与宫颈癌密切相关。大量研究证明持续HPV感染是引起宫颈癌的主要病因，且HPV载量与宫颈癌转归密切相关。HPV与CIN和宫颈癌有密切关系,HPV感染应视为与CIN相关的早期病变[5]从CIN到浸润性宫颈癌的演变过程中，高危HPV感染是宫颈癌的主要致癌因子之一。当宫颈上皮感染HPV后细胞增殖活性升高，抑制及破坏人体局部的免疫功能，从而促进细胞过度增殖最终癌变[6]。吴兵[7]等报道HPV基因亚型分布与地区分布有关，存在一定的地区差异；Munoz[2]等示不同地区引起宫颈癌的HPV病毒亚型也不尽相同。本研究对本地区2960例妇女HPV感染情况及21种基因亚型分布情况进行流行病学回顾性分析，结果显示，共检测到20种亚型，未发现43亚型，与王长奇等报道基本一致[8]，符合亚洲高危HPV的流行现状[9]。28.04%的感染率低于浙江地区的33.08%[9]及北京地区的57.10%[10]，高于呼和浩特地区13.04%[11]及深圳地区的17.50%[12]，高危型HPV感染 (23.68%)明显高于低危型HPV感染(4.36%)，高危型以 16、52、58 亚型为主，而低危型以11、6亚型为主，与国际癌症研究协会(IARC)最新调查结果基本一致[13]；在HPV感染患者中，单一亚型感染654例，占78.80%，明显高于多重亚型感染，说明该地区主要以单一亚型感染为主；多重感染者中以二重感染为主(占60.00%)，另见一例七重感染者。据报道单一亚型感染可使宫颈癌的发病风险增加19.9倍，而多重HPV亚型感染可使宫颈癌的发病风险增加31.8倍[14]，表明HPV多重感染增加了宫颈癌患病率。年龄是HPV及宫颈癌发病的另一相关因素，在所分析各年龄段中，以20~30岁、>50岁年龄段阳性率较高，呈现“双峰”状，与Giulianu[15]报道基本一致，多数学者认为呈现此现象原因可能与性行为、性伴侣、激素及抵抗力等因素有关。

综上所述，HPV感染及HPV亚型分布存在地区差异，且与女性年龄相关，因此非常有必要对不同地区的HPV感染特点进行流行病学调查，为当地卫计委因地制宜地制订最佳宫颈癌方案提供理论依据。

[1]王敏,丁悦,温展,等.宫颈上皮内瘤变临床特点及危险因素分析[J].现代诊断与治疗,2013 24(16):3754-3755.

[2]Munoz N,Bosch FX,Castellsagué X,et al.Against which human papillomavirus types shall we vaccinate and screen?The international perspective[J].Int J Cancer,2004,111(2):278-285.

[3]董玉兰,徐冉,陈龙山,等.3394例女性患者宫颈人乳头瘤病毒基因分型及临床意义[J].实验与检验医学,2014,32(4):440-442.

[4]孙晓燕.高级别宫颈上皮内瘤变的临床诊断治疗分析[J].中国实用医药,2014,9(11):35-36.

[5]王敏,丁悦,温展,等.宫颈上皮内瘤变临床特点及危险因素分析[J].现代诊断与治疗,2013,24(16):3754-3755.

[6]赵连爽,陈静静,云科,等.沈阳地区人乳头瘤病毒感染分布及宫颈病变的相关分析[J].国际检验医学,2014,35(17):2280-2284.

[7]吴兵,张崇移,李铭芬,等.人乳头状瘤病毒感染与宫颈病变的相关性研究[J].中华医院感染学,2013,23(10):2377-2379.

[8]王长奇,王康,陈燕萍,等.HPV多重感染与宫颈病变关系的分析[J].实验与检验医学,2012,2(30):166-168.

[9]王乐见,李招云,史春娟,等.2913例妇女生殖道人乳头瘤病毒感染筛查分析[J].疾病监测，2009,24(11):849-851.

[10]杨英捷,赵健,李雪倩,等.2285例女性下生殖道人乳头状瘤病毒感染筛查结果分析[J].中国实用妇科与产科,2006,22(6):444-445.

[11]张健,孟和宝,力高,等.呼和浩特地区宫颈疾病患者人乳头瘤病毒DNA分型检测分析[J].华北国防医药,2010,22(2):124-125.

[12]何桂蓉,武学成.深圳地区女性人乳头瘤病毒基因类型分析[J].现代检验医学,2007,22(2):19-21.

[13]陶萍萍,卞美璐,欧华,等.导流杂交基因芯片技术在人乳头状瘤病毒检测中应用的研究[J].中华妇产科,2006,41(1):43-47.

[14]Lee SA,Kang D,Seo SS,et al.Multiple HPV infection in cervical cancer screened by HPVDNA Chip[J].Cancer Lett,2003,198(2):187-92.

[15]Giulianu AR，Lazcano-Ponce E，Villa LL，et al．The human papilloma virus infection in men study：human papillomavirus prevalence and type distribution among men residing in Brazil，Mexico and the United States[J]．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2008,17(3):2036-2043．