一株扭角羚弗格森埃希菌的分离鉴定及药敏试验

叶 泥，权自芳，王 彬，谌利民，杨 艳，颜其贵＊

（1.四川农业大学动物医学院，四川雅安625014；2.四川省广元市青川县青溪镇唐家河管理处，四川广元628019）

扭角羚又称羚牛，是我国一级保护动物，并被列入濒危野生动植物种国际贸易公约附录Ⅱ，一共有4个亚种，其中秦岭亚种和四川亚种为中国所特有。它属于牛科羊亚科，喜群居，常年栖息于高海拔的高山悬崖地带。弗格森埃希菌（Escherichiafergusonii）属于肠杆菌科埃希菌属，存在于自然环境及人和动物肠道内，是人和动物少见的条件致病菌［1］，能引起人和动物菌血症、创伤感染、胸膜感染和腹泻等疾病。目前，国内关于此菌的报道不多。2013年，陶元勇等［1］从一名恶性肿瘤患者术后感染伤口中分离出弗格森埃希菌。此外，有报道指出在患者的痰液［2］、中段尿［3］、肺脓肿液［4］中都分离到该菌，由此提示当机体的抵抗能力下降时，此菌能使人患病或继发感染而加重其他疾病。2005年，Herrez P等［5］从一只死亡鸵鸟的坏死组织中只分离到弗格森埃希菌，并证实该菌使鸵鸟患上坏死性盲肠炎，并致其死亡。2007年，Hariharan H 等［6］从腹泻山羊的粪便中分离出弗格森埃希菌，并从肝、肾、肠、肺中也分离出相同菌株。进一步说明了该菌的致病性。有研究显示，近年来弗格森埃希菌对用于治疗肠道细菌感染的抗菌药物有耐受性，并且其耐药表型与大肠埃希菌十分相似［7-8］。本研究从野生扭角羚肝脏中分离鉴定出了弗格森埃希菌，并进一步做了生化和药敏分析，以期为弗格森埃希菌的研究积累资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 采自2014年四川省某自然保护区1只死亡的青壮年扭角羚的心、肝、脾、肺、肾，送到本实验室做自然生存过程中致病性细菌的检测，以期寻找扭角羚死亡原因。

1.1.2 主要试剂 胎牛血清为Invitrogen公司产品；MH固体培养基、山梨醇麦康凯培养基、抗菌药物纸片及生化反应微量管为杭州微生物试剂有限公司产品；2×TaqPCR Master-Mix、DNA 标准 DL 2 000为OMEGA公司产品；引物合成和测序均由上海英骏生物技术有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养与纯化 将组织块无菌条件下，取心、肝、脾、肺、肾深部组织小块。接触于加有100mL／L胎牛血清的LB固体培养基中并用波尔划线进行初步分离，培养24h后，只有肝脏样品接种的培养基上长出了细菌，对该菌进一步分离培养。无菌挑取由肝脏初步分离得到的单个菌落接种于含100mL／L胎牛血清的LB固体培养基中进一步分离纯化，37℃培养24h后，挑选单个菌落，取单个菌落的一半进行革兰染色，另一半再次接入含100mL／L胎牛血清的LB固体培养基上，37℃培养24h后，选取菌落，将单个菌落的一半接种于含100mL／L胎牛血清的LB液体培养基中，37℃振荡培养24h，菌液用于涂布MH培养基，另一半用于菌落PCR扩增16SrDNA。

1.2.2 16Sr DNA的PCR 扩增 试验中共选取了3个独立菌落进行菌落PCR，引物为16SrDNA的通用引物，27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，上、下游引物各1.5μL，2×TaqPCR Master Mix 20μL，ddH2O 27μL，最后用枪头挑入单个菌落，轻轻吹打混匀，最终反应体系为50μL。PCR扩增程序为：95 ℃ 10min；95 ℃ 30s；53 ℃ 30s；72 ℃90s，30个循环；72℃10min，4℃结束反应。取10μL进行琼脂糖凝胶电泳，余下的PCR产物送出测序，测序后将序列在NCBI数据库进行Blast比对分析。

1.2.3 生化试验 将纯培养的单个菌落接种于肠杆菌科细菌生化微量鉴定管和山梨醇麦康凯培养基，37℃培养24h后观察试验结果。

1.2.4 药敏试验 药敏试验采取纸片扩散法，使用临床常用于动物疾病治疗的药物纸片，在无菌条件下，用棉签沾取菌液均匀涂布于MH培养基，贴上药敏纸片，将培养皿放于培养箱，37℃培养24h后，测量各抑菌环直径。结果判定参照美国临床实验室标准委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）标准。

2 结果

2.1 细菌形态

初步分离所得的细菌，在含100mL／L胎牛血清的LB固体培养基上纯化培养后，呈白色、湿润、光滑菌落。革兰染色镜检发现菌体为长短不一的阴性杆菌，呈细丝、弯曲状（图1）。培养48h后，镜检发现菌体细长，多成弯曲状。在山梨醇麦康凯培养基上能生长，并有胆盐析出，形成较小的红色、浑浊菌落。

图1 培养后的分离菌株形态（革兰染色，10×100）Fig.1 Escherichia fergusonii＇s morphology after culture（Gram staining，10×100）

2.2 16SrDNA的序列分析

菌株16Sr DNA PCR扩增条带大小为1 410bp，Blast比对结果表明其与弗格森埃希菌的同源性超过99%，初步判定该菌株为弗格森埃希菌，菌落PCR电泳图见图2。

图2 弗格森埃希菌16SrDNA的菌落PCR扩增结果Fig.2 Colony PCR amplification of Escherichia fergusonii 16SrDNA

2.3 生化特性

乳糖、甘露糖、麦芽糖、氨对、靛基质、甲基红、吲哚、动力、硝酸盐还原和枸橼酸盐生化反应呈阳性。赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、硫化氢、卫矛醇、苯丙氨酸、尿素、蔗糖及VP反应呈阴性，葡萄糖发酵产酸产气（表1）。结合16SrDNA序列分析结果，确定分离菌为弗格森埃希菌。

表1 分离株生化反应结果Table 1 The results of biochemical reactions of strain

2.4 药敏试验结果

本次所得的弗格森埃希菌分离株对环丙沙星、氟苯尼考、头孢他啶、丁胺卡那等敏感，对氨苄西林耐药（表2）。

表2 药敏试验结果Table 2 The results of drug sensitivity test

3 讨论

目前，对弗格森埃希菌的了解较少，只有少量报告称该菌能使人和动物致病或死亡［5-6］，本研究中的菌株是从死亡的扭角羚肝脏中分离所得，可能为致死此扭角羚的病源菌。细菌16Sr DNA序列长度适宜且保守区域在细菌进化过程中高度保守，这为鉴定不同种属的细菌提供了科学依据。通过对分离株16Sr DNA序列的测序和与数据库中已有的序列比对，就可确定出分离株的种属地位，从而弥补了仅依靠细菌形态、生化特性等传统方法判定的不足，本研究中获得的分离菌经细菌16SrDNA测序分析和生化特性鉴定，确定该分离株为弗格森埃希菌。

本次从肝脏中获得的分离菌株与陶元勇等［1］对弗格森埃希菌标准株ATCC35469的生化反应结果存在一定差异，分离株的赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶生化反应为阴性而标准株为阳性。此结果可能是由地域生态环境的差异和细菌生化反应的不确定性造成［9］。

根据已有文献认为弗格森埃希菌逐渐对用于治疗肠道细菌感染的抗菌药物有耐受性［7-8，10］。本研究中使用了14种常见抗菌药物对此分离株进行药物敏感试验，发现其只对氨苄西林有强耐药性，而陆彦等［11］在雏鸡中发现的弗格森埃希菌的药物敏感试验结果显示，雏鸡中分离的弗格森埃希菌对氨苄西林、恩诺沙星、四环素等高度耐药，相比之下本研究中的弗格森埃希菌分离株的耐药性要低很多，此结果可能是因野生动物很少接触抗菌药物所致。此次从扭角羚中分离到弗格森埃希菌不仅增加了该菌感染野生动物的资料，而且增加了弗格森埃希菌的致病性资料，为弗格森埃希菌研究积累了数据资料。

［1］陶元勇，孙铭艳，李建花，等.弗格森埃希菌的生物学特征研究与16SRrna检测［J］.中国病原生物学杂志，2013，8（3）：229-232.

［2］刘青芹，胡秀伟，李金钟.痰液中分离1株弗格森埃希菌及文献复习［J］.国际检验医学杂志，2011，32（2）：283-284.

［3］周 静，李珍大，王卫萍，等.中段尿分离1株弗格森埃希菌［J］.临床间验杂志，2003，21（3）：186.

［4］王 勇，孙晓鹏，黄听明，等.弗格森埃希菌致肺脓肿1例［J］.黑龙江医药科学，1999，22（10）：2.

［5］Herrez P，Rodrquez A F.Espinosafergusoniiin ostriches（Struthiocamelus）［J］.Avian Dis，2005，49（1）：167-169.

［6］Hariharan H，Lpea A，Conboy G，et al.Isolation ofEscherichiafergusoniifrom the feces and internal organs of a goat with diarrhea［J］.Can Vet J，2007，48（6）：630-631.

［7］Bush K，Jacoby G A.An updated functional classification ofβlactamases［J］.Antimicrob Agents Chemother，2010，54（6）：969-976.

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［11］陆 彦，赵红玉，齐晓丽，等.弗格森埃希菌的鉴定及药敏试验［J］.动物医学进展，2013，34（5）：48-51.