蟾酥毒理学及检测方法研究进展

翟金晓，刘 伟

（1.司法部司法鉴定科学技术研究所 上海市法医学重点实验室，上海200063；2.苏州大学 医学部 生物化学与分子生物学，江苏 苏州215123）

鉴定综述
R e v i e w

蟾酥毒理学及检测方法研究进展

翟金晓1，2，刘 伟1

（1.司法部司法鉴定科学技术研究所 上海市法医学重点实验室，上海200063；2.苏州大学 医学部 生物化学与分子生物学，江苏 苏州215123）

蟾酥是蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍的耳后腺或皮肤腺分泌物,经加工干燥而成。临床上广泛应用于抗肿瘤、强心、麻醉止痛等方面。蟾酥的化学成分复杂，药理作用很强，且毒性很大，有关蟾酥中毒案件时有报道。本文结合近年来关于蟾酥的研究作一综述,总结了蟾酥的化学成分、毒理学、药理学、药代动力学及检测方法等,以期为法医毒理学工作者提供参考。

蟾酥；蟾蜍甾烯类；中毒；毒物学；检测；LC-MS/MS

蟾蜍为蟾蜍科蟾蜍属动物，蟾蜍属动物有260余种，其中我国有13个亚种的蟾蜍属动物，资源较为丰富，在全国大部分地区均有分布[1]。蟾蜍全身皆可入药，如蟾酥、蟾皮、干蟾、蟾蜍头、蟾蜍舌、蟾蜍肝、蟾蜍胆等。而中药蟾酥的来源为中华大蟾蜍（Bufo bufo gargarizans Cantor）或黑框蟾蜍（Bufo melanostictus Schneider）的耳后腺及皮肤腺的干燥分泌物。蟾酥具有抗肿瘤升压、强心、镇痛等多种药理活性，同时毒性又很大，因此，有关蟾酥中毒案件时有报道[2-4]。本文综述了蟾酥的化学成分、毒理学、药理学、药代动力学及检测方法方面的研究，以期为法医毒理学工作者提供参考。

1 蟾酥的化学成分

蟾酥的化学成分复杂，迄今为止，从蟾酥中分离得到的化学成分主要包括蟾蜍甾烯类、吲哚类生物碱、环酰胺和小分子环肽、甾醇及其他类化合物，蟾蜍甾烯类分为蟾毒配基和蟾蜍毒素两类，蟾蜍毒素为蟾毒配基3位被精氨酸二碳酸酯、硫酸酯等取代的衍生物[5]。它们既是蟾酥的有效成分，又是其毒性成分。蟾蜍甾烯类（bufadienolides）成分是一类C-17位连接α-吡喃酮环（六元不饱和内酯环），A/B环顺式或反式稠合，B/C环反式稠合，而C/D为顺式稠合，C-3多羟基取代的甾体类化合物。该类成分多具有强心、局部麻醉、抗休克、抗病毒等多种药理活性，尤其是其抗肿瘤活性十分显著，肿瘤细胞的半数抑制率IC50为1~100nmol/L。对于蟾酥及其制剂中蟾蜍甾烯类化学成分的研究有着重要的意义。

马骁驰等[6]对蟾酥的氯仿萃取物进行化学成分研究，分离得到3个主要的蟾蜍甾烯类成分：华蟾酥毒基（cinobufagin，1）、脂蟾毒配基（resibufagenin，2）和蟾毒灵（bufalin，3），和5个甾体类化合物，利用核磁共振氢谱（1H-NMR），碳谱（13C-NMR）鉴定这些化合物，分别为：蟾毒它灵（bufotalin，4），南美蟾毒精（marinobufagin，5），华蟾毒它灵（cinobufotalin，6），12β-羟基-蟾毒灵（12β-hydroxyl-bufalin，7），5，7β-二羟基-脂蟾毒配基（5，7β-dihydroxyl-resibufagenin，8）（结构式见图1）。脂蟾毒配基和华蟾酥毒基是蟾蜍甾烯类的主要代表物质，是蟾酥的主要活性成分和毒性成分。

图1 化合物1-8的化学结构式

2 蟾酥的毒理学及药代动力学研究

蟾酥药理活性强，临床应用广泛、疗效显著，尤其在抗肿瘤、强心、麻醉止痛等方面具有极佳的疗效。在临床上，蟾酥被用于多种中药成方制剂中。在蟾毒灵、华蟾毒精、六神丸、麝香保心丸、梅花点舌丸、蟾酥注射液等中均有蟾酥成分，如麝香保心丸由麝香、苏合香、蟾酥和肉桂等七味中药组成，用于治疗心肌缺血引起的胸闷、心绞痛及心肌梗死等疾病。此外，蟾酥又是毒性很大的药物，用药不当会出现严重的毒副作用。梁晓萍等[7]总结出如长期或过量服用蟾酥可出现循环、消化及神经系统等的中毒症状。蟾蜍毒素及蟾蜍配基主要作用于心脏迷走神经中枢或末梢，并可直接作用于心肌，引起心率缓慢、心律不齐等缓慢心律失常症状，使房室传导阻滞，最后导致心跳停止于收缩期[8-9]；吲哚烷基类化合物有致幻作用；儿茶酚类化合物可引起各器官组织的微小血管剧烈收缩，导致组织缺血缺氧[10]。蟾酥吸收快，作用消失得也快，蓄积性很小。Xie JT等[11]和Ko RJ等[12]研究表明，人的蟾酥急性中毒症状表现为呕吐、呼吸急促、肌肉痉挛、惊厥和心律不齐等。虽然人们对蟾酥毒性早有认识，但目前研究主要集中在蟾酥的化学成分分析及药理作用[13-15]，而对蟾酥的毒性作用机制仍不清楚。张慧卿等[16]研究也表明，蟾酥急性中毒症状多表现为呕吐、呼吸急促、肌肉痉挛、惊厥和心律不齐等方面[17]。急性毒性实验结果表明，蟾酥各种成分对小鼠半数致死量如下：蟾酥为41.0mg/kg（静脉注射），96.6mg/kg（皮下注射），36.24mg/kg（腹腔注射）；蟾毒灵为2.2mg/kg（腹腔注射）；华蟾毒精为4.38mg/kg（腹腔注射）；脂蟾毒配基为4.25mg/kg（快速静脉注射），15mg/kg（慢速静脉注射），14mg/kg（腹腔注射），124.5mg/kg（皮下注射），64mg/kg（口服给药）；蟾蜍它灵对狗的半数致死量约为0.36mg/kg（静脉注射），口服最小致死量约为0.98mg/kg。静脉或腹腔注射蟾酥注射液，小鼠急性中毒为呼吸急促，肌肉痉挛，心律不齐，最后麻痹而死，阿托品对此有一定的解毒作用，肾上腺素则无。蟾酥经煮沸后毒性大减[18]。Ma H等[19]研究表明，中药牛黄可有效缓解蟾酥所致的心律失常等副作用，可作为一种蟾酥中毒的解救剂。

由于蟾酥毒性较大，故其提取物的体内药动学特点是重要的研究课题。梁研等[20]动物实验结果表明蟾蜍甾烯在小肠中的吸收率是在胃中的2.5～7倍。极性小的蟾蜍甾烯比极性大的蟾蜍甾烯更容易被胃肠道吸收。小肠远端内容物对蟾蜍甾烯的转化能力较弱，盲肠内容物对蟾蜍甾烯的转化能力最强，华蟾毒精在盲肠中的转化率超过了90%。

刘冬等[21]建立了兔血浆中蟾毒灵（BL）及脂蟾毒配基（RBG）的液相色谱法（HPLC），并将该法用于蟾蜍甾烯类化合物的药代动力学研究。该方法取新西兰兔6只，雌雄各半，以0.35mg/kg剂量，由耳缘静脉注射蟾酥提取物溶液（20%乙醇生理盐水溶液配制，0.6g/L），分别于给药后2，5，10，15，30，45，60，90min取血，每次约2.0mL，肝素抗凝，经3500 r/min离心10min。测定兔血浆中BL，RBG质量浓度，得血药浓度-时间数据，经Kinetica 4.4.1软件非房室模型拟合，得到兔在给药后的平均血药浓度-时间曲线（见图2），发现华蟾酥毒基较其他成分在兔体内代谢速度极快，且现有文献及相关研究表明，华蟾酥毒基在大鼠以及犬体内的代谢速度明显慢于其在兔体内的代谢。

图2 BL，RBG兔血浆中的浓度-时间曲线（n=6）

3 蟾蜍甾烯类的提取与检测

3.1 蟾酥的提取

蟾酥中的有毒成分较为复杂，一般是针对于蟾酥中蟾蜍甾烯类中的几种主要物质进行提取检测，蟾酥提取方法主要有溶剂提取法；提取工艺采用加热回流法、超声提取法、固相萃取法等。刘冬等[22]通过实验比较了不同提取溶剂对蟾酥有毒成分蟾毒灵（BL）、华蟾酥毒基（CBG）、脂蟾毒配基（RBG）的提取率的影响，发现，采用80%、90%乙醇及无水乙醇提取蟾酥提取液中的BL、CBG、RBG均较2010年版《中国药典》蟾酥含量测定项中提取方法的提取率更高。袁旭江等[23]通过实验比较了加热回流法和超声提取法对蟾酥有毒成分华蟾酥毒基和脂蟾毒配基提取率的影响，结果表明加热回流法的提取率更高。Yan Liang等[24]通过实验比较发现，与液液萃取法相比，固相萃取法不仅能清除生物样本中的干扰物质，而且还能够提高目标物的提取回收率。

3.2 蟾酥的检测

蟾酥的药理活性强，且毒性很大，人一旦服用不当则会发生中毒甚至死亡的案件。因此，在法医毒物学等领域，蟾酥有毒成分的检测已受到研究人员的关注。目前针对蟾酥的检测主要包括两大领域：一是在药物安全与质量评价领域，通过一定的提取方法检测蟾酥或蟾酥制品中的有毒成分蟾蜍甾烯类含量是否符合安全标准，含量是否在药用剂量的安全量下限；二是在法医毒物学领域，研究服用蟾酥或其制品后，蟾酥在人或动物体内的毒物动力学情况，为蟾酥中毒案件的取材与鉴定提供一定的指导意义。

3.2.1 蟾酥中有毒成分的体外检测方法

蟾酥中有毒成分的检测方法主要有HPLC[25-31]、液相色谱-质谱串联法（LC-MS/MS）[32][包括高效液相色谱-电喷雾串联质谱法（LC/ESI-MS/MS）[33]和高效液相色谱-大气压电离串联四极杆质谱法（HPLC/APCIMS/MS[34]）]等（表1）。通过分析蟾酥及其制品中的有毒成分及其含量，为药物安全及其质量评价提供参考依据。

HPLC在蟾酥及其制品的检测中应用较为广泛，通过对蟾酥或其中药制品进行一定的前处理，再进行检测。因蟾酥及其中药制品成分复杂，故其前处理条件也较为复杂。一般的前处理方法是将蟾酥或其制品通过溶剂提取并配合加热回流或超声提取来提高提取率达到净化目的。加热回流法是指用乙醇等易挥发的有机溶剂提取原料成分，将浸出液加热蒸馏，其中挥发性溶剂馏出后又被冷却，重复流回浸出容器中浸提原料，如上周而复始，直至有效成分回流提取完全的方法。而超声提取法则是利用超声波所产生的空化等特殊作用，将药物中所含化学成分快速高效地提取出来的一项提取技术。这两种前处理方法一般都是选用合适的溶剂如乙醇配合超声提取和旋转蒸发来进行处理，将得到的提取物再通过不同的膜过滤后再进行分析。而滤膜孔径的大小也对其提取物的纯度有一定的影响。如Yongmei Hu等[33]选用的是0.22 um的膜来进行过滤，相比于传统的0.45 um的滤膜孔径小较多，从而达到了更好的分离纯化效果。Min Ye等[34]在实验中运用了硅胶柱色谱法对蟾酥提取物进行了纯化，并将得到的物质通过制备液相色谱法进一步纯化，从而得到了较高的提取率。

而LC-MS/MS比之HPLC更为高效、灵敏，王兆基等[32]建立了华蟾毒它灵、蟾蜍灵、华蟾毒配基及脂蟾毒配基的LC-MS/MS检测方法。比较了蟾酥样本的液相色谱－质谱/质谱法分析数据。对4个不同来源中华大蟾蜍及黑眶蟾蜍的蟾酥样本进行检测，测得华蟾毒它灵、蟾蜍灵、华蟾毒配基及脂蟾毒配基的质量分数范围为0.05%～5.12%。Yongmei Hu等[33]在实验中使用LC/ESI-MS/MS进行分析，其得到的30种主要化合物的最低检测限范围为0.25～0.50 pg/uL，回收率高达83%～106%。

表1 蟾酥及其制品的前处理及检测方法

3.2.2 生物检材中蟾酥的主要化学成分检测

生物检材中蟾酥中的蟾蜍甾烯类化合物的检测可为中毒判断提供依据，目前对体内蟾蜍甾烯类化合物的检测方法主要HPLC[21，24]，液相色谱-质谱联用法（LC-MS）[35]，高效液相色谱-飞行时间质谱（HPLC/TOFMS）[36]等。其中应用最广的为HPLC，刘冬[21]等人采用乙腈沉蛋白与液液萃取相结合方法进行血浆样品预处理，建立了兔血浆中蟾毒灵及脂蟾毒配基的HPLC测定法，为中药蟾酥提取物的药代动力学研究提供参考。

其次是LC-MS，陈建新等[31]建立了高效液相色谱-质谱法鉴定大鼠灌胃给予蟾酥总内酯提取物后血浆中蟾蜍二烯内酯类化合物及其主要代谢物的分析方法，选用了乙腈沉淀蛋白法，鉴定了24种蟾蜍二烯内酯类化合物和20种可能的代谢物。可以看出该方法快速、灵敏，适用于血浆中微量蟾蜍二烯内酯类化合物及其代谢物的测定。

Cao Y等[36]在实验中运用HPLC/TOF-MS检测了犬单次灌胃给予六神丸后血液中的蟾蜍甾烯类物质及其药代动力学特征。此方法中最低检出限为0.15 ng/mL，适用于体内痕量蟾蜍甾烯类物质的检测及其药代动力学考察。

4 研究展望

虽然生物检材中蟾酥的检测方法已有一些报道，但这些方法中的前处理方法较为复杂耗时，检材比较单一，且方法大多未进行全面的方法学验证。而在法庭毒物分析领域，蟾酥中毒后需要及时取材并进行快速准确的分析，对于不同检材，如血液、尿液及组织中蟾酥的分析均较为重要，这就需要建立一个简便、快速、准确的方法为蟾酥中毒的法医学鉴定提供依据。液相色谱-质谱联用法（LC-（MS）n）是将HPLC的高分离能力和MS的高分辨能力相结合，已经在药物及毒物分析方面得到了广泛的应用，对体内痕量毒药物的检测有一定的优势。因此，为满足法医毒物分析和临床毒物分析的需要，可建立灵敏、简便的生物体液及组织中蟾酥有毒成分检测的LC-MS/MS方法，为蟾酥中毒案件中痕量有毒成分的分析提供可靠的理论依据。

目前蟾酥毒理学方面也已有报道，但药物动力学方面现在主要以血液为检材进行相关的药代动力学研究与分析，并未见组织分布、排泄等方面的研究。在法医毒物分析领域，毒物动力学研究具有一定的指导意义，在药物的毒性剂量下药物在体内的吸收、分布、代谢、排泄过程会有所改变。因此，建立适当的动物模型，研究蟾酥在动物体内的毒物动力学过程能为法医学鉴定中蟾酥中毒案件的取材及检测结果的评价提供更多有价值的参考信息。

另外，在已报道的研究中，因蟾酥所含化学成分复杂，各实验中所检测的化学成分并不统一，而在法医毒物学方面，相关报道更是甚少，因此确定蟾酥中毒中的检测目标物及其可能代谢物，为法医学鉴定中有关蟾酥中毒案件中的检测与筛选评价、此类案件的鉴定提供可靠依据和指导信息。

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（本文编辑：卓先义）

Advances in the Study of Toxicology and Determ ination of Venenum Bufonis

ZHAIJin-xiao1,2,LIUWei1
(1.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Institute of Forensic Science,Ministry of Justice,Shanghai200063,China; 2.Department of Biochemistry and Molecular Biology,Soochow University,Suzhou 215123,China)

Venenum bufonis is the dry powder of the secretion from Bufo bufogargarizan Cantor or B.melan ostictus Schneider’s ear gland or dermal gland.It is widely applied as anti-tumor agent,cardiotonic,narcotic analgesic,etc.in clinicalmedicine. Venenum bufonis’s chemical composition is very complex.It has strong toxicity as well as pharmacological effects.Therefore, cases of venenum bufonis poisoning have been reported now and then.This paper reviewed the studies of venenum bufonis’s chemical composition,toxicology,pharmacology,pharmacokinetics and analyzing methods in recent years,providing reference for forensic toxicology peers.

venenum bufonis;bufadienolides;poisoning;forensic toxicology;determination;LC-MS/MS

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2015.02.015

1671-2072-（2015）02-0080-06

2014-12-31

上海市法医学重点实验室资助项目（14DZ2270800）

翟金晓（1989—），女，硕士研究生，主要从事法医毒物学研究。E-mail：zhaijinxiao@126.com。

刘伟（1963—），女，主任法医师，硕士研究生导师，主要从事法医毒物学研究。E-mail：liuw@ssfjd.cn。