HPLC测定急性淋巴细胞白血病患儿甲氨蝶呤血清浓度及应用实践研究

曲晓宇，张四喜，赵健琦，宋燕青

(吉林大学第一医院 药学部，吉林 长春 130021)



HPLC测定急性淋巴细胞白血病患儿甲氨蝶呤血清浓度及应用实践研究

曲晓宇，张四喜，赵健琦，宋燕青Δ

(吉林大学第一医院 药学部，吉林 长春 130021)

目的 采用HPLC法检测急性淋巴细胞白血病患儿血清中甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)的浓度并对其应用进行研究。方法 采用Wondasil C18-WR色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.15%磷酸(21︰79)，流速为1 mL/min，检测波长306 nm，血清样品经高氯酸去蛋白后取20 μL进样分析并对患儿监测结果建立监测档案。结果 甲氨蝶呤血清样品在0.02～50 μg/mL范围内线性关系良好(r=0.9990，n=6)，方法平均回收率为96.50%，日间与日内精密度RSD均小于15%。对6例患儿监测结果建立档案，3个疗程后4例患儿甲氨蝶呤血药浓度波动小且均处于安全范围内，可减少监测频次。结论 本方法准确性好、操作简单，完全满足甲氨蝶呤血药浓度监测的需要。对各疗程间血药浓度稳定且处于安全范围的患儿建立档案，可减少其检测次数，减少患儿抽血的痛苦、减轻家庭经济负担。

甲氨蝶呤；高效液相色谱法；血药浓度；监测；应用实践

大剂量甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)冲击治疗结合亚叶酸钙(calcium folinate,CF)解救是治疗儿童急性淋巴细胞白血病(actu lymphoblastic leukemia,ALL)的主要手段之一，该疗法能够大大减少ALL的发生，对儿童ALL的治疗起到了关键作用[1]。在该方案实施过程中，如采用传统方法即按体表面积计算MTX用量给药时，不同患儿间MTX的稳态血药浓度(Css)个体差异很大。文献报道，一定的Css和疗效相关，而过量的CF会影响MTX的药物疗效，而当MTX达到中毒剂量时，未及时给予CF解救又会产生毒性反应，因此，临床上往往需要通过监测MTX血药浓度，以调整CF的用量与次数，以避免中毒反应的发生、提高疗效[2-4]。本研究采取高效液相色谱法测定患儿血清中的MTX浓度，并对部分患儿建立MTX血药浓度监测档案，为本院开展ALL患儿MTX血药浓度监测工作提供实践经验。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 甲氨蝶呤对照品(中国食品药品检定研究院，批号：10138-201104)；甲醇(美国TEDIA公司，色谱纯)；高氯酸为分析纯，蒸馏水为本实验室自制；健康人空白血清由本院输血科提供，患儿血清由本院小儿肿瘤科提供。

1.2 仪器 Shimadzu 16-A液相色谱仪、SPD-16紫外检测器(日本岛津公司)；80-2B台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；高速离心机(美国ABBOTT公司)；FA2004分析天平(上海舜宇恒平公司)。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件：岛津Wondasil C18-WR色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，Wondasil C18-WR保护住(4.0 mm×10 mm，5 μm)，流动相甲醇—0.15%磷酸溶液(21︰79)，流速1 mL/min，紫外检测波长306 nm。

1.3.2 样品处理：取5 mL未加入抗凝剂静脉血(红色盖头抽血管)，4000 r/min离心5 min，取上层淡黄色液体即为血清样品。取200 μL血清样品，滴加甲氨蝶呤对照品溶液20 μL，再加入20%高氯酸溶液30 μL，涡旋混合30 s，于10900 r/min条件下离心10 min，取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后，取20 μL进样分析。

1.3.3 系列标准血清样品与质控血清样品的制备：取甲氨蝶呤对照品精密称定后，用10%磷酸溶液配制成100 μg/mL的甲氨蝶呤对照品贮备液。用空白血浆和甲氨蝶呤贮备液分别配制浓度为0.02、0.05、0.1、0.25、0.5、1.00、2.00、5.00、10.00、25.00、50.00 μg/mL的甲氨蝶呤系列标准血清样品。同法配制浓度为甲氨蝶呤浓度为0.02、0.05、1.28及32.00 μg/mL的质控血清样品。各血清样品分别装于2 mL塑料离心管中，置-4 ℃冰箱保存备用。

1.3.4 标准曲线绘制：采取分段法绘制甲氨蝶呤系列标准血清样品的标准曲线，其中低浓度标准曲线由0.02、0.05、0.1、0.25、0.5、1.00 μg/mL 6个浓度绘制，高浓度标准曲线由1.00、2.00、5.00、10.00、25.00、50.00 μg/mL 6个浓度绘制。经微孔滤膜过滤后，取20 μL进样分析。

1.3.5 专属性：分别取甲氨蝶呤对照品、空白血清和血清样品及患者用药后血清样品按照样品处理方法处理后进样，考察色谱行为的专属性。

1.3.6 加样回收率与精密度测试：采用外标法检测，另外配制甲氨蝶呤质控对照溶液，分别测定线性末端浓度0.02 μg/mL，线性末端3倍浓度0.05 μg/mL，中间浓度1.28 μg/mL及高浓度75%范围的32.00 μg/mL 4个浓度水平的甲氨蝶呤质控血浆样品以检测加样回收率。另外，取质控血浆样品进样，检测日间精密度(5个工作日每份样品每天测定1次)及日内精密度(每份样品平行测定6次)。

1.3.7 方法应用考察：对本院2015年1月1日～2015年5月30日期间小儿肿瘤科应用甲氨蝶呤大剂量冲击疗法治疗ALL的部分患者进行甲氨蝶呤血药浓度监测，共涉及患儿6例，其中男4例，女2例，年龄3～13岁，均为需多疗程化疗的ALL患儿。ALL患儿血药浓度监测点为用药后24、48和72 h，甲氨蝶呤在3个时间点的中毒浓度分别为>10、1和0.1 μmol/L[5]，每位患儿监测3个疗程。

2 结果

2.1 专属性 结果显示，甲氨蝶呤对照品在14.4 min处出峰，空白血清在甲氨蝶呤对照品出峰处无杂峰干扰，背景干净。见图1。

图1 各样品溶液的高效液相色谱图A.空白血浆；B.甲氨蝶呤对照溶液；C.甲氨蝶呤血清样品；D.患者血清Fig.1 HPLC of each sample solutionA.Blank serum; B.Methotrexate control solution; C.Serum sample contained with methotrexate; D.ALL children serum

2.2 标准曲线绘制 结果显示，以峰面积(X)对浓度(Y)进行线性回归，低浓度标准曲线在0.02～1.00 μg/mL范围内线性关系良好，回归方程为：Y=2×10-5X-0.041(r=0.9990，n=6)；高浓度标准曲线在1.00～50 μg/mL范围内线性关系良好，回归方程为：Y=2×10-5X+0.018(r=0.9990，n=6)，MTX检测线为0.02 μg/mL。

2.3 回收率与精密度 经加样回收率测定方法，得平均回收率为96.50%，日内精密度与日间精密度均满足RSD<15%。见表1。

表1 样品加样回收率测定与精密度测定结果Tab.1 Results of recoveries and RSD within day and between days

2.4 方法应用结果 进行监测的ALL患儿MTX具体用药方法及监测结果，见表2。对6例患儿的监测结果显示有4例患儿各疗程间MTX血药浓度波动很小且均在安全剂量范围。3号患儿与4号患儿在相同给药剂量下各疗程MTX血药浓度波动较大，其中4号患儿治疗过程中MTX达到了中毒浓度，对其进行增加一次CF解救处置，在用药后96 h时间点增加一次MTX血药浓度监测，对其96 h时间点的MTX血药浓度监测结果显示均为未检出。3号患儿虽未达到中毒浓度，但疗程间MTX血药浓度波动较大，因此建议其继续监测，暂不减少监测次数。

表2 ALL患儿基本情况及甲氨蝶呤血药浓度监测结果Tab.2 Information of ALL children and monitoring data of MTX blood concentration

3 讨论

由于甲氨蝶呤血药浓度个体差异较大，对开始进行甲氨蝶呤大剂量冲击疗法治疗的ALL患儿进行血药浓度监测，能够有效的提示因甲氨蝶呤浓度高于中毒浓度而引起的不良反应，帮助临床医生做出判断以采取有效措施，同时，CF解救剂量过大又会引起甲氨蝶呤浓度下降而影响疗效。有研究表明，目前常用的快速检测方法如酶联免疫技术等存在抗体交叉反应，造成MTX测定结果偏高[6]。本研究建立高效液相色谱法监测甲氨蝶呤血药浓度的方法，该方法稳定、可靠，且操作简单，成本低廉。由于MTX不溶于甲醇与乙腈，因此前处理采用高氯酸进行沉淀蛋白，基线平稳不影响测定[7-8]。本研究对患儿监测结果进行建档并建议多疗程监测结果稳定且均在安全浓度范围内的患儿适当减少监测频次，以减少患儿痛苦、减轻家庭经济负担，取得了良好的效果。同时本研究发现，给药后48 h血药浓度与72 h具有一定的相关性，因此在48 h测定值在安全浓度范围内的患儿可不再监测72 h血药浓度[9-10]。本研究为临床应用提供了参考依据。

[1] 梅艳，汪洋，宋新文，等.儿童急性淋巴细胞白血病化疗中甲氨蝶呤血药浓度监测结果分析[J].中国临床药理学杂志，2012，28(8)：566-568.

[2] 宋新文，汪洋，刘炘，等.高效液相色谱法测定人血清甲氨蝶呤的浓度[J].中国临床药理学杂志，2014，30(5)：448-450.

[3] 彭波.高效液相色谱法测定甲氨蝶呤的血药浓度[J].中国医院药学杂志，2011，31(11)：951-952.

[4] 华瑛，赵卫红，卢新天，等.大剂量甲氨蝶呤目标浓度个体化调整研究[J].中华儿科杂志，2008，46(3)：203-208.

[5] 陈渝军，林晶，周军，等.甲氨蝶呤的血药浓度对亚叶酸钙用药方案的指导作用[J].中国新药与临床杂志，2005，24(2)：134-135.

[6] 张善堂，杨林海，孙言才，等.HPLC法测定急性淋巴细胞白血病患儿血清中甲氨蝶呤浓度[J].中国药房，2008，19(11)：825-827.

[7] 李勇，梁光荣.高效液相色谱法测定人体血浆中甲氨蝶呤浓度的改进[J].中国药师，2013，22(23)：17-19.

[8] 张诗海，孙丽.高效液相色谱法测量患儿血清甲氨蝶呤浓度[J].国际检验医学杂志，2014，35(13)：1762-1763.

[9] 谢军平，冯玲玲，匡霞.HPLC测定大剂量甲氨蝶呤患者血药浓度[J].中国实验方剂学杂志，2010，16(11)：69-72.

[10] 华瑛，赵卫红，卢新天.大剂量甲氨蝶呤消除相血药浓度及其影响因素[J].实用儿科临床杂志，2010，25(3)：211-214.

(编校：王冬梅)

Determination of serum concentration of methotrexate in children with acute lymphoblastic leukemia by HPLC and application practice research

QU Xiao-yu, ZHANG Si-xi, ZHAO Jian-qi, SONG Yan-qingΔ

(Department of Pharmacy, The First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, China)

ObjectiveTo determine serum concentration of methotrexate in children with acute lymphoblastic leukemia by HPLC and explore the application practice.MethodsThe separation was performed in a Wondasil C18-WR column (4.6 mm×150 mm, 5 μm) with a mobile phase of methanol-0.15%phosphoric acid solution(21:79) and determined at 306 nm.The sample of serum was centrifuged after protein precipitation with perchloric acid.Detected results for children to establish monitoring files.ResultsThe linearity was well at 0.02～50 μg/mL of methotrexate(r=0.9990，n=6).The average recovery was 96.50%, RSD of within day and between days were less than 15%.Established monitoring files for six children and after 3 courses of treatment, the blood concentration of methotrexate in 4 children were small and they were in a safe range, which could reduce the frequency of monitoring.ConclusionThis method is simple, sensitive and accurate for methotrexate detection in serum.The children with stable concentration and within safety range, can reduce monitioring frequency.It could bring the children less pain and relieve the burden of family.

methotrexate; HPLC; blood concentration; monitoring; application practice

曲晓宇，男，硕士，主管药师，研究方向：临床药学， E-mail：quxiaoyuhaha@163.com；宋燕青，通讯作者，女，博士，主管药师，研究方向：医院药学， E-mail：350740439@qq.com。

R733.71

A

1005-1678(2015)08-0176-03