瓜蒌多糖的体内免疫活性研究

张岫秀，蔡盈，吴中梅，高勇（.徐州市儿童医院，江苏徐州22006；2.徐州市医学科学研究所，江苏徐州22006）

瓜蒌多糖的体内免疫活性研究

张岫秀1，蔡盈1，吴中梅1，高勇2，*
（1.徐州市儿童医院，江苏徐州221006；2.徐州市医学科学研究所，江苏徐州221006）

摘要：研究瓜蒌多糖对免疫抑制小鼠的免疫促进作用。通过腹腔注射环磷酰胺制备免疫抑制小鼠模型，考察不同剂量瓜蒌多糖对免疫抑制小鼠脏器指数、巨噬细胞吞噬能力和淋巴细胞增殖能力的影响。瓜蒌多糖可显著提高免疫抑制小鼠脏器指数、巨噬细胞吞噬能力和淋巴细胞增殖能力。瓜蒌多糖具有良好的免疫增强活性，具有较高的研究与开发价值。

关键词：瓜蒌；多糖；免疫增强活性

瓜蒌为葫芦科植物栝楼 Trichosanthes kirilowii Maxim.或双边栝楼Trichosanthes rosthornii Harms的干燥成熟果实，据《中国药典》2010版记载，瓜蒌归肺、胃、大肠经，具有清热涤痰，宽胸散结，润燥滑肠等功效，在我国应用历史悠久，范围广泛。研究发现，瓜蒌果实营养价值较高，干燥的瓜蒌果实约含粗蛋白19%，碳水化合物41%，脂肪4.8%，含有丰富的有机酸、生物碱、挥发油、甙类、黄酮类等化合物[1]。有关瓜蒌有机酸、氨基酸、挥发油、黄酮类化合物的研究已有报道，而对瓜蒌多糖的活性研究鲜有报道，越来越多的研究发现，多糖具有较多的生物活性，如增强免疫力、抗氧化、降血糖、抗肿瘤等，利用价值较高，本研究对瓜蒌多糖进行了提取和纯化，并研究了其体内免疫活性，为进一步开发利用瓜蒌资源提供了试验支持。

1　试验材料

1.1试剂

环磷酰胺（批号：13110925）：江苏恒瑞医药股份有限公司；RPMI-1640培养基：上海浩然生物技术有限公司；刀豆素A（ConA）：北京中生瑞泰科技有限公司；噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、Sephadex-G100、Sephadex-G75：北京索莱宝科技有限公司；ADS-5大孔吸附树脂：天津波鸿树脂科技有限公司；鸡红细胞：广州蕊特生物科技有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.2仪器

RE52CS-1旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；FD-1B-50冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；EP2.5 96孔板离心机：广州科侨实验技术设备有限公司；752PC型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；MK3型酶标仪：Thermo Fisher。

1.3材料

瓜蒌：经河北省农林科学院药用植物研究中心谢晓亮主任鉴定为葫芦科植物栝楼的干燥果实。

2　试验方法

2.1瓜蒌多糖制备与含量测定

水提醇沉法制备瓜蒌粗多糖[2]，粗多糖经Sevag法脱除蛋白，采用ADS-5大孔吸附树脂脱除色素，采用Sephadex-G100和Sephadex-G75柱去除其他杂质[3-4]。收集洗脱液，真空浓缩，真空冷冻干燥，获得高纯度瓜蒌多糖，采用苯酚-硫酸法[5]测定瓜蒌多糖含量。

2.2瓜蒌多糖体内免疫活性测定

2.2.1小鼠分组与造模处理

将50只昆明种雄性小鼠（体重17 g～21 g）随机平均分成5组，空白对照组、模型对照组、瓜蒌多糖低剂量组、瓜蒌多糖中剂量组和瓜蒌多糖高剂量组。各组正常饲养一周后，模型对照组和瓜蒌多糖低、中、高剂量组小鼠每天腹腔注射CTX 40 mg/kg，灌胃生理盐水0.3 mL，空白对照组小鼠每天腹腔注射相同体积的生理盐水，灌胃生理盐水0.3 mL。一周后，瓜蒌多糖低、中、高剂量组小鼠分别每天灌胃不同浓度多糖溶液0.3 mL，高、中、低剂量分别为150、100、50 mg/kg，模型组和空白对照组每天灌胃生理盐水0.4 mL，连续灌胃21 d。

2.2.2小鼠脏器指数测定[6-7]

末次给药24 h后，各试验组取5只小鼠，秤取活重，然后将小鼠脱颈椎处死，立即于无菌条件下摘取胸腺和脾脏，将表面水分吸干，分别于分析天平上称重，计算胸腺和脾脏指数。

胸腺指数/（mg/g）=胸腺重量/小鼠活重

脾脏指数/（mg/g）=脾脏重量/小鼠活重

2.2.3小鼠吞噬细胞吞噬能力测定[8]

小鼠末次给药后1 h，每个实验组各取5只小鼠，分别向腹腔内注射0.5 mL 3%鸡红细胞，10 h后脱颈椎处死。剪开小鼠腹部皮肤，采用3 mL生理盐水冲洗腹腔，轻揉，吸取数滴冲洗液于载玻片上，涂布均匀，然后将载玻片置于湿纱布中，37℃孵育30 min，生理盐水冲洗，晾干后采用瑞氏染液染色，油镜镜检。每个载玻片选择视野较清晰处各计数200个巨噬细胞，分别计算吞噬率和吞噬指数。

吞噬百分率/%＝（吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞数/ 200）×100

吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞数/200

2.2.4小鼠淋巴细胞增殖能力测定[9-11]

取2.2.2所得小鼠脾脏，无菌研磨，过200目细胞筛，制备脾细胞悬液，采用RPMI-1640完全培养液调整细胞悬液至细胞个数为2.5×106个/mL，各取400 μL 至96孔培养板中，加入200 mg/L ConA溶液10 μL，培养基代替ConA溶液做对照，于37℃、5%CO2培养箱中培养72 h。培养结束前4 h各取上清液300 μL，加入MTT溶液（5 mg/mL）60 μL，继续培养至结束。离心弃上清，各加入37℃DMSO 600 μL，振荡10 min，酶标仪测定570 nm处吸光值，计算淋巴细胞增殖指数

脾淋巴细胞增殖指数/%＝（A处理－A对照）/A对照×100

（4）

式中：A处理为加ConA孔吸光值；A对照为空白孔吸光值。

2.3数据处理

数据采用SAS9.1软件进行统计分析，以平均值±标准差（x±SD）表示数值，差异显著性分析采用单因素方差分析。

3　试验结果

3.1瓜蒌多糖提取结果

瓜蒌多糖含量测定标准曲线：Y=0.007 1x-0.052 1，R2=0.997，纯化后多糖得率为1.14%，多糖含量为92.62%。

3.2瓜蒌多糖对小鼠脏器指数的影响

瓜蒌多糖对免疫抑制小鼠免疫器官指数的影响见表1。

表1　瓜蒌多糖对免疫抑制小鼠免疫器官指数的影响（x±SD）Table 1　Effect of Trichosanthes kiriiowii Maxim polysaccharide on immune organ indexes in immunosuppressive mice（x±SD）

由表1可以看出，模型组小鼠胸腺指数和脏器指数较正常组均显著降低（P<0.01），说明免疫抑制模型造模成功。与模型组相比，中、高剂量组瓜蒌多糖可以极显著增加胸腺重量（P<0.01），也可以显著增加脾脏重量（P<0.05，P<0.01），低剂量组脏器指数增加不明显。

3.3瓜蒌多糖对小鼠吞噬细胞吞噬能力的影响

瓜蒌多糖对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响见表2。

由表2可以看出，模型组小鼠巨噬细胞的吞噬功能较正常组显著降低（P<0.01），表明免疫抑制模型造模成功。高剂量瓜蒌多糖可显著提高免疫抑制小鼠巨噬细胞的吞噬能力，与模型组相比，吞噬率显著提高（P<0.05），吞噬指数极显著提高（P<0.01），中剂量瓜蒌多糖也可显著提高吞噬指数（P<0.05）。

表2　瓜蒌多糖对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响（±SD）Table 2　Effect of Trichosanthes kiriiowii Maxim polysaccharide on abdominal cavity macrophage function in immunosuppressive mice （±SD）

表2　瓜蒌多糖对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响（±SD）Table 2　Effect of Trichosanthes kiriiowii Maxim polysaccharide on abdominal cavity macrophage function in immunosuppressive mice （±SD）

注：**与正常组比较P<0.01；#与模型组比较P<0.05；##与模型组比较P<0.01；-表示未添加。

组别　剂量/ （mg/kg）　吞噬率/%　吞噬指数正常组　-　39.571±4.352　0.519±0.067模型组　-　27.603±3.563**　0.352±0.047**瓜蒌多糖低剂量组　50　31.432±3.373　0.402±0.052瓜蒌多糖中剂量组　100　33.614±4.653　0.437±0.051#瓜蒌多糖高剂量组　150　35.522±4.558#　0.472±0.063##

3.4瓜蒌多糖对小鼠淋巴细胞增值能力的影响

瓜蒌多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响见表3。

表3　瓜蒌多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响（±SD）Table 3　Effect of of Trichosanthes kiriiowii Maxim polysaccharide on lymphocyte proliferation in immunosuppressive mice（x±SD）

表3　瓜蒌多糖对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响（±SD）Table 3　Effect of of Trichosanthes kiriiowii Maxim polysaccharide on lymphocyte proliferation in immunosuppressive mice（x±SD）

注：**与正常组比较P<0.01；#与模型组比较P<0.05；-表示未添加。

组别　剂量/（mg/kg）　脾淋巴细胞增殖指数正常组　-　88.634±9.126模型组　-　63.157±8.273**瓜蒌多糖低剂量组　50　71.328±8.656瓜蒌多糖中剂量组　100　75.457±7.629#瓜蒌多糖高剂量组　150　80.359±8.573#

由表3可以看出，模型组小鼠脾淋巴细胞的增殖能力较正常组显著降低（P<0.01），免疫抑制模型造模成功。与模型组相比，中、高剂量组瓜蒌多糖可以显著增强免疫抑制小鼠脾淋巴细胞的增殖能力（P<0.05）。

4　结论

本试验通过腹腔注射环磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型，采用脏器指数评价、巨噬细胞吞噬能力测定和淋巴细胞增殖能力测定3种方法考察瓜蒌多糖对免疫抑制小鼠免疫能力的影响。

胸腺指数和脾脏指数是评价机体免疫能力的重要方法之一，可反映体内淋巴细胞水平，进而反映机体免疫能力的强弱。本研究发现瓜蒌多糖可显著提高免疫抑制小鼠脏器指数，对提高小鼠免疫能力具有积极影响。巨噬细胞吞噬能力可反映机体非特异性免疫能力水平，参与机体抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节，对维持机体内环境稳定具有重要作用[8]。本研究发现瓜蒌多糖能显著提高免疫抑制小鼠巨噬细胞的吞噬能力，表明瓜蒌多糖对小鼠的非特异性免疫功能具有促进作用。淋巴细胞转增殖能力是评价机体细胞免疫功能的重要指标，也是反映机体特异性免疫水平的重要标志，本试验中瓜蒌多糖可以提高小鼠淋巴细胞增殖能力，可提高小鼠特异性免疫能力。

本研究中瓜蒌多糖对提高免疫抑制小鼠脏器指数水平、巨噬细胞吞噬能力和淋巴细胞增殖能力均有积极影响，且随灌胃剂量增加，促进作用越明显，表明瓜蒌多糖对免疫抑制小鼠特异和非特性免疫功能均有促进作用，可提高免疫抑制小鼠的免疫功能水平。综上，瓜蒌多糖具有良好的免疫增强活性，但其免疫调节机制尚不清楚，因此进一步纯化瓜蒌多糖、分析其组成，并从细胞、分子等多层面探讨其作用机制的工作有待于进一步展开。此外，多糖应用安全性高、范围广泛，瓜蒌多糖具有良好的免疫增强活性，应用前景广阔，具有较大的开发利用价值。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.004

收稿日期：2015-11-03

基金项目：徐州市卫生科技资源现状调查与分析（xkqz030）

作者简介：张岫秀（1964—），女（汉），副主任护师，学士，主要从事儿科护理与临床研究。

*通信作者：高勇（1967—），主任技师。

Study on Immunity-enhancing Effect of Polysaccharide from Trichosanthes kiriiowii Maxim

ZHANG Xiu-xiu1，CAI Ying1，WU Zhong-mei1，GAO Yong2，*
（1.Xuzhou Children's Hospital，Xuzhou 221006，Jiangsu，China；2.Xuzhou Institute of Medical Science，Xuzhou 221006，Jiangsu，China）

Abstract：To investigate the immunity-enhancing effect of Trichosanthes kiriiowii Maxim polysaccharide on immunosuppressive mice.Mice were injected with CTX to establish the immunosuppressive model.The effects of different doses of Trichosanthes kiriiowii Maxim polysaccharide on the index of thymus and spleen，peritoneal macrophage activity and lymphocyte proliferation activity were detected.Trichosanthes kiriiowii Maxim polysaccharide was effective in improving the immune function of immunosuppressive mice，improved the index of thymus and spleen，increased the phagocytic activity of peritoneal macrophage，proliferation activity of lymphocytes.Trichosanthes kiriiowii Maxim polysaccharide have better immunity-enhancing effect on immunosuppressive mice，should be further studied for development and application.

Key words：Trichosanthes kiriiowii Maxim；polysaccharide；immunity-enhancing effect