胃癌耐药细胞株SGC7901/阿霉素中miR-185的表达及对细胞多药耐药性的影响

李 勇，檀碧波，范立侨，赵 群，王 冬，刘 羽，刘庆伟

胃癌发病率近年有所下降，但仍居消化道恶性肿瘤首位。化疗是胃癌综合治疗的主要措施之一，而较强的多药耐药性(MDR)常造成胃癌化疗失败，患者预后较差［1-2］。胃癌MDR的发生机制和逆转研究是目前研究的热点，但尚未取得重要进展。近期microRNA在恶性肿瘤中的作用已成为肿瘤发病机制及治疗的研究热点，有研究发现某些microRNA在胃癌MDR中发挥作用，也有研究显示microRNA-185(miR-185)与肿瘤的增殖、凋亡、侵袭及MDR有关［3-5］，但miR-185与胃癌MDR关系的相关研究报道较少。本研究检测了胃癌细胞株SGC7901和耐阿霉素 (ADR)的细胞株SGC7901/ADR中miR-185表达情况，并应用 miR-185模拟物转染SGC7901/ADR，初步探讨了miR-185参与胃癌MDR的作用机制。

1 材料与方法

1.1 病理资料 选取2014年3—5月于河北医科大学第四医院行胃癌切除术的20例患者胃癌及癌旁组织标本。患者男14例，女6例;年龄36～73岁，平均年龄 (56.6±9.0)岁;术前均经胃内镜病理活检确诊。患者术后TNM分期为ⅡB～ⅢC期，均为中高分化腺癌。患者术前均未接受放化疗等治疗。术中肿瘤切除后取胃癌组织和癌旁组织 (距离肿瘤边缘大于3 cm，术后病理证实无癌细胞存在)各1份，1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm，置于液氮中保存，尽快转入-80℃深低温冰箱，用于后续实验。本研究经本院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 细胞株及试剂 人胃腺癌细胞株SGC7901由本院科研中心保种，正常胃上皮细胞株GES-1购自中国科学院上海细胞研究所，细胞株SGC7901/ADR由第四军医大学消化病研究所樊代明院士惠赠。RPMI 1640培养液、胰蛋白酶购自美国Gibco公司;Trizol试剂、脂质体购自美国Invitrogen公司;反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂购自美国Promega公司;PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成;miR-185模拟物购自美国AB公司;miR-185荧光定量PCR检测试剂盒购自美国GeneCopia公司;蛋白提取试剂盒购自美国Bio-rad公司;MDR1/P-gp、MRP-1、GST-π、LRP及 GAPDH抗体购自美国Santa Cruz公司;MTT试剂购自美国Sigma公司;ADR购自浙江海正药业股份有限公司，10 mg/支;5-氟尿嘧啶 (5-FU)购自西安海欣制药有限公司，250 mg/支;草酸铂 (LOHP)购自江苏恒瑞医药股份有限公司，50 mg/支。

1.3 细胞培养 细胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中培养，2～3 d传代1次。取对数生长期的细胞经消化分散后计数，制成细胞悬液备用。SGC7901/ADR细胞在含有0.4 mg/L的ADR中培养以维持其耐药表型。

1.4 miR-185模拟物合成及转染 细胞株SGC7901/ADR以密度为4×105个/ml接种于6孔板，置入37℃、95%湿度、5%CO2培养箱内常规培养24 h。转染前用无血清无抗生素的RPMI 1640培养液清洗细胞，用RPMI 1640培养液稀释的miR-185模拟物或无关对照序列以及转染试剂脂质体，混合静置后转染SGC7901/ADR细胞。转染24 h后，取转染效率＞90%的细胞株进行后续实验。

1.5 细胞株SGC7901/ADR体外药敏试验 分别将ADR、5-FU、L-OHP加入经miR-185模拟物或无关对照序列转染及未转染的细胞株SGC7901/ADR各6个复孔，置入37℃、95%湿度、5%CO2培养箱内培养24 h。

于培养结束前4 h加入5 mg/ml的MTT 20 μl。培养结束后，弃去培养液，各孔加入150 μl DMSO，室温振荡15 min，采用酶标仪于波长490 nm处测定吸光度值 (OD值)。以上实验重复3次。计算各药物对细胞株SGC7901/ADR的抑制率，抑制率=(对照OD值-待测OD值)/对照OD值，其中对照OD值由未加入药物的细胞株SGC7901/ADR同步培养测定。

1.6 细胞株SGC7901/ADR多药耐药基因mRNA及各细胞株miR-185表达 采用Trizol一步法提取总RNA，取2 μg反转录合成 cDNA。取 2 μl反转录产物、10 μl SYBR Green Mix、多药耐药基因上下游引物各0.5 μl，按试剂盒说明建立终体积为20 μl的PCR体系。PCR热循环参数为:95℃ 5 min，94℃30 s，60℃ 30 s，进行45个循环。应用Primer 5.0设计多药耐药基因引物序列:MDR1/P-gp(F):5'-GTGGGGCAAGTCAGTTCATT-3'， (R):5'-TCTTCACCTCCAGGCTCAGT-3';MRP-1(F):5'-GGGGTCCTCATTATCTTCTGG-3'， (R):5'-TGGTCTCAGGGTAGGGGTTAG-3';GST-π(F):5'-GGAGACCTCACCCTGTACCA-3'， (R):5'-GGCTAGGACCTCATGGATCA -3';LRP (F):5'-ACCAACCCTGACGACAGAAG-3'， (R):5'-CATGTCTCCCGATCTCTGGT-3'。内参基因GAPDH(F):5'-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3'， (R):5'-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'。采 用 2-ΔΔCt法 计 算 各 基 因mRNA的相对表达水平。各细胞株miR-185表达同样采用上述荧光定量PCR测定，严格按microRNA检测试剂盒说明进行。

1.7 细胞株SGC7901/ADR多药耐药蛋白表达 采用Western blotting法测定多药耐药蛋白相对表达水平。对转染细胞株SGC7901/ADR培养24 h后提取总蛋白，进行蛋白定量后，取60 μg于12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至PVDF膜，置入TBST配制的5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别用稀释后的多药耐药蛋白一抗或内参一抗4℃孵育过夜，经TBST漂洗3次后，加相应辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育1 h，化学发光法显色，对条带进行积分吸光度扫描，计算多药耐药蛋白相对表达水平。

1.8 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计分析，计量资料以 (±s)表示，两组间比较采用t检验;多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-185相对表达水平比较 癌旁组织和胃癌组织miR-185相对表达水平分别为 (0.910±0.142)、 (0.243±0.045)，差异有统计学意义 (t=20.025，P＜0.001)。细胞株GES-1、SGC7901、SGC7901/ADR miR-185相对表达水平分别为 (0.903 ± 0.117)、 (0.630 ± 0.101)和 (0.191±0.030)，差异有统计学意义 (F=46.850，P＜0.001)。其中，细胞株SGC7901、SGC7901/ADR miR-185相对表达水平低于GES-1，细胞株SGC7901/ADR miR-185相对表达水平低于 SGC7901(P＜0.05)。

2.2 各药物对不同转染处理后的细胞株SGC7901/ADR的抑制率 ADR、5-FU和L-OHP对不同转染处理后的细胞株SGC7901/ADR抑制率比较，差异均有统计学意义 (P＜0.05)。其中，ADR、5-FU和L-OHP对miR-185模拟物转染的细胞株SGC7901/ADR抑制率高于未转染和无关对照序列转染 (P＜0.05，见表1)。

2.3 细胞株SGC7901/ADR经转染后多药耐药基因mRNA相对表达水平 经不同转染处理后，细胞株SGC7901/ADR多药耐药基因LRP mRNA相对表达水平比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。经不同转染处理后，细胞株SGC7901/ADR多耐药基因MDR1/P-gp、MRP-1和GST-π mRNA相对表达水平比较，差异有统计学意义 (P＜0.05)。其中，miR-185模拟物转染的细胞株SGC7901/ADR多药耐药基因MDR1/P-gp、MRP-1和GST-π mRNA相对表达水平低于未转染和无关对照序列转染 (P＜0.05，见表2)。

表1 各药物对不同转染处理后的细胞株SGC7901/ADR抑制率的比较(±s，%，n=3)Table 1 Comparison of inhibition rate of drugs on cell SGC7901/ADR by different transfected

表1 各药物对不同转染处理后的细胞株SGC7901/ADR抑制率的比较(±s，%，n=3)Table 1 Comparison of inhibition rate of drugs on cell SGC7901/ADR by different transfected

注:与未转染比较，*P＜0.05;与无关对照序列转染比较，△P＜0.05;ADR=阿霉素，5-FU=5-氟尿嘧啶，L-OHP=草酸铂

处理因素37.2 ±5.7 40.9 ±6.0 36.6 ±4.4无关对照序列转染 38.9±5.0 42.7 ±5.3 38.3±5.0 miR-185模拟物转染 74.7±9.7＊△ 81.7±5.4＊△ 69.5±7.2＊△F ADR 5-FU L-OHP未转染0.001 ＜0.001 ＜0.001 26.800 50.640 31.770 P值值

表2 不同转染处理后的细胞株SGC7901/ADR多药耐药基因mRNA相对表达水平的比较 (±s)Table 2 Comparison of multidrug resistance gene mRNA relative expression levels of cell SGC7901/ADR by different transfected

表2 不同转染处理后的细胞株SGC7901/ADR多药耐药基因mRNA相对表达水平的比较 (±s)Table 2 Comparison of multidrug resistance gene mRNA relative expression levels of cell SGC7901/ADR by different transfected

注:与未转染比较，*P＜0.05;与无关对照序列转染比较，△P＜0.05

处理因素 MDR1/P-gp MRP-1 GST-πLRP未转染 0.980±0.101 0.876±0.116 0.951±0.073 1.117±0.121无关对照序列转染 0.969±0.148 0.853±0.103 0.910±0.099 1.027±0.125 miR-185模拟物转染 0.253±0.038＊△ 0.325±0.061＊△ 0.566±0.065＊△ 1.119±0.187 F 值＜0.001 ＜0.001 0.002 0.699 46.565 31.472 20.791 0.383 P值

2.4 细胞株SGC7901/ADR经转染后多药耐药基因蛋白相对表达水平 经不同转染处理后，细胞株SGC7901/ADR LRP蛋白相对表达水平比较，差异无统计学意义 (P＞0.05)。经不同转染处理后，细胞株SGC7901/ADR MDR1/P-gp、MRP-1和GST-π蛋白相对表达水平比较，差异有统计学意义 (P＜0.05)。其中，miR-185模拟物转染后细胞株SGC7901/ADR MDR1/P-gp、MRP-1和GST-π蛋白相对表达水平低于未转染和无关对照序列转染 (P＜0.05，见表3)。

3 讨论

胃癌是我国常见的恶性肿瘤，治疗效果不佳，其重要原因是胃癌细胞的MDR常导致化疗失败［6-7］，胃癌MDR机制并进行逆转已成为目前研究的热点。然而，目前尚未发现导致胃癌细胞MDR的关键基因和确切逆转MDR的药物。因此，寻找在胃癌细胞MDR中发挥作用的新基因并分析其作用机制有重要意义。

表3 不同转染处理后的细胞株SGC7901/ADR多药耐药基因蛋白相对表达水平的比较 (±s)Table 3 Comparison of multidrug resistance protein relative expression levels of cell SGC7901/ADR by different transfected

表3 不同转染处理后的细胞株SGC7901/ADR多药耐药基因蛋白相对表达水平的比较 (±s)Table 3 Comparison of multidrug resistance protein relative expression levels of cell SGC7901/ADR by different transfected

注:与未转染比较，*P＜0.05;与无关对照序列转染比较，△P＜0.05

处理因素 MDR1/P-gp MRP-1 GST-πLRP未转染 0.777 ±0.110 0.825 ±0.105 0.807±0.069 0.534±0.069无关对照序列转染 0.799 ±0.121 0.799 ±0.118 0.790±0.097 0.560±0.075 miR-185模拟物转染 0.367±0.055＊△ 0.326±0.035＊△ 0.433±0.066＊△ 0.520±0.079 F 值0.003 0.001 0.002 0.807 17.904 27.133 21.670 0.221 P值

microRNA由于对下游基因具有强大的调节功能而成为近期肿瘤研究的热点。研究表明，miR-21、let-7、miR-27等多个microRNA均与胃癌相关［8-10］。miR-185是新近发现与恶性肿瘤关系密切的microRNA，参与多种恶性肿瘤的增殖、侵袭、迁移，并与子宫内膜癌细胞对顺铂的耐药性相关［3-5］。而关于miR-185与胃癌MDR关系目前研究很少。本研究发现，胃癌组织miR-185相对表达水平低于癌旁组织，耐药细胞株SGC7901/ADR miR-185相对表达水平低于正常胃上皮细胞株GES-1和胃腺癌细胞株SGC7901，提示miR-185可能参与胃癌MDR的发生。以miR-185模拟物转染细胞株SGC7901/ADR，使miR-185表达上调，细胞对化疗药物的敏感性明显增强，证实miR-185参与了胃癌MDR调节，上调miR-185有逆转胃癌细胞MDR特性的作用，有可能成为今后治疗胃癌的靶基因，具有进一步深入研究的价值。

miR-185参与胃癌MDR的机制在于miR-185可介导其靶基因沉默，故本研究进一步从分子水平对miR-185上调后细胞中胃癌MDR基因MDR1/P-gp、MRP-1、GST-π、LRP的mRNA及其蛋白表达水平变化进行检测。MDR1/P-gp、MRP-1基因是肿瘤MDR经典途径的代表基因，其表达蛋白存在于肿瘤细胞膜上，可将化疗药物泵出细胞外而导致MDR［11-12］;GST-π蛋白具有降解细胞内药物的功能，能使药物解毒成为无害物质而排出细胞外［13］;LRP则可以阻止药物进入细胞核或将药物泵出细胞核外，后通过胞吐作用将药物排 出 细 胞［14］。本 研 究 发 现，细 胞 株 SGC7901/ADR经miR-185模拟物转染，多药耐药基因MDR1/P-gp、MRP-1、GST-π mRNA和蛋白表达水平均明显降低，提示，miR-185对上述胃癌MDR基因具有抑制作用。同时，miR-185模拟物转染并未影响LRP的表达，说明miR-185可能仅通过调节部分胃癌MDR基因而参与胃癌MDR。

综上所述，胃癌细胞miR-185表达下调，通过上调miR-185的表达可提高胃癌细胞对化疗药物的敏感性，其机制可能是miR-185调控部分多药耐药基因的表达。本研究结论提示miR-185有可能成为胃癌治疗的新靶点，但本研究仅从分子水平进行了体外实验，且miR-185对MDR基因调控的具体机制尚不完全明确，有待进一步体内研究及分子间作用机制研究予以阐明。

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