利用有机溶剂提取微藻油脂的方法探究

殷海，许瑾，王忠铭，郝小红，袁振宏，王亚兵

（1 上海理工大学能源与动力工程学院，上海 200093；2 中国科学院广州能源研究所，广东 广州 510640 ）

能源是人类赖以生存的基础，是促使经济可持续发展的动力。目前为止，人类使用的能源绝大多数来自于传统的化石燃料。然而随着传统化石能源的逐步耗尽、环境污染的日益严重，人们迫切要求可持续的发展，急需寻找新的清洁能源来替代传统能源。生物质能源由于数量庞大、种类繁多的独特优势，已经被越来越多的决策者和科研人员所关注。

微藻作为一种用于生产生物柴油的极具潜力的生物质原料，逐渐成为人们关注的焦点[1-2]。微藻分布广泛，种类繁多，并且适应能力极强，作为能源生物质，其还具有光合作用效率高、生产周期短、油脂产量高且品质优良、不与粮食竞争[3-4]，同时微藻还可以消耗环境中的CO2[5]等优点，使得微藻能源在新型可再生替代能源中显得尤为突出。

微藻生物柴油的生产工艺包括微藻的规模化培养、微藻的采收、微藻油脂的提取和生物柴油的转化等一系列环节[6]。其中，微藻油脂的提取是影响生物柴油推广应用的一个关键环节。目前，微藻油脂的常用提取方法主要包括压榨法和水酶解法，这些方法的油脂提取残油率高[7]；其次有超临界流体萃取、离子液体提取法[8-9]以及水热液化技术[10]，这些方法对设备要求较高，成本较大[11]，并且超临界流体萃取对于极性脂的提取率较低[12]；还有索氏提取法，该方法具有提取周期较长、能量消耗高、提取率低的特点；而最常见的是有机浸提法，该方法虽然对有机溶剂具有很强的选择性，但其对设备要求低、操作简单、提取率较高。

溶剂浸提法是利用能溶解油脂的有机溶剂，通过渗透、湿润、对流扩散和分子扩散等作用，将微藻中的油脂溶解在溶剂中，再通过将浸提溶剂和油脂分离，进而得到粗脂[13]。极性溶剂能有效破坏膜蛋白间结合力，使得细胞膜疏松多孔，非极性溶剂可以很好的与细胞内油脂结合[14]，这使得双溶剂体系在油脂提取中占有一定的优势。本实验利用有机溶剂提取微藻油脂，探究了不同的条件对微藻油脂提取率的影响，为微藻生物柴油的实际生产提供一定的理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 微藻材料

小球藻藻粉，由中国科学院广州能源研究所佛山三水能源微藻培养示范基地提供。

1.2 仪器设备

NewClassic 电子天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌水浴锅，河南巩义予华仪器有限公司；TDL-5-A 型离心机，上海安亭科学仪器厂；HGC/HSC 系列氮吹仪，广州易测仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 微藻培养及藻粉制备

所用微藻为中国科学院广州能源研究所三水区能源微藻培养示范基地户外大型跑道池内养殖的小球藻，通过离心机收集微藻后，利用喷雾干燥设备制取得到干燥的藻粉，将干燥的藻粉密封放置在4℃的冰箱中待用。

1.3.2 提取剂的选择

目前利用有机溶剂提取微藻油脂所用的提取剂主要包括氯仿-甲醇[15]、正己烷-异丙醇[16]、DMSO-甲醇混合液[17]、正己烷[18]、DUB、DUB-辛醇、二氯甲烷-甲醇[19-21]等，但是这些有机溶剂存在毒性强、成本高或沸点高难以分离等缺点。因此采用成本相对较低、沸点较低、毒性低的沸程为60～90℃的石油醚作为提取剂，同时使用甲醇和石油醚两种有机溶剂作为提取剂进行了实验探究。

1.3.3 微藻油脂提取

称取200mg±10mg 的干燥藻粉于螺口的玻璃瓶中，按每次实验所设计的液料比加入相应量的有机溶剂，放入所设计温度下的恒温加热磁力搅拌水浴锅中，搅拌相应的时间后，取出玻璃瓶放入离心机中，在3500r/min 的转速下离心5min，收集上清液，在氮气保护下蒸发溶剂，转移含有少量溶剂的总脂到预先称重的EP 管中，在氮气保护下蒸发溶剂至恒重，称量得到总脂的质量，计算得出有油脂的提取率。

在使用甲醇-石油醚两种有机溶剂提取微藻油脂时，按相应的液料比在玻璃管中第一次加入甲醇试剂，放置在所设定温度的水浴锅中加热一定的时间，离心收集上清液后，再向玻璃管的剩余固体内加入等量的石油醚，恒温加热相同的时间，离心收集上清液，合并两次所得的上清液，添加等量的去离子水使溶液分层，静置10min，收集上层包含总脂成分的混合液后在氮气作用下吹干至恒重，称量得到总脂的质量，并计算得出油脂的提取率。

考察各种工艺参数对油脂提取率的影响以及实验误差的存在，每组实验设置一个平行组，实验重复两次。

1.3.4 提取率的计算

微藻含油率的测定采用Bligh-Dyer 的快速油脂提取方法[22]，经测定本实验所用微藻的含油率为11.07%。

2 结果与分析

2.1 提取时间对提取率的影响

在微藻油脂的提取中，提取时间对提取率有一定的影响。如果提取时间过短，有机溶剂不能充分穿透微藻的细胞膜进入细胞内，不能充分地与细胞内的油脂接触；同时本实验的单一有机溶剂采用的是石油醚（沸程60～90℃），低沸程的石油醚具有较强的挥发性，故提取时间过长会导致石油醚挥发造成有机溶剂的浪费，并且在工业应用时，提取时间过长必然导致生产周期变长，从而降低油脂提取效率同时增加生产成本。故实验设计3h、4h、5h、6h 共4 个时间点，探究不同的时间对于该微藻的油脂提取率的影响，结果如图1 所示。

图1 提取时间对微藻油脂提取率的影响

由图1 可以看出，在提取时间小于4h 时，油脂的提取率维持在一个较低的值；当提取时间超过4h时，油脂提取率上升；而提取时间超过5h 后，提取率上升速度变慢。这一实验结果和实验前的理论分析相吻合。但是从图1 可以看出，时间的变化对油脂提取率的影响不明显，故在本次实验中提取时间不作为影响提取率的主要因素。综合考虑，在本实验中所设计实验的提取时间为5h。

2.2 液料比对提取率的影响

利用有机溶剂提取微藻油脂主要是利用传质推动力，同时利用固相主体和液相主体之间的浓度差[23]，从而使藻体内的油脂被携带出来，所以液料比就是影响这一进程的重要因素。液料比过小，会使得传质推动力变小，不易将藻细胞内的油脂提取出来；而液料比过大会增加有机溶剂的使用量，从而使得成本大大升高，不利于大规模的推广应用。因此，选择一个合适的液料比十分必要。本次实验按照有机溶剂的体积（mL）与微藻的质量（g）比分别为5mL/g、10mL/g、15mL/g、20mL/g 和30mL/g探究了在不同液料比时的提取率，所得实验结果如图2 所示。

图2 液料比对微藻油脂提取率的影响

结果表明，在较低的液料比的情况下即所加入的有机溶剂较少时，提取率非常低；随着所加入的有机溶剂的含量增多，提取率显著升高；最后保持在某一个定值。为了获取较高的微藻油脂提取率，选取液料比为15mL/g 作为最佳的工艺条件。

2.3 温度对提取率的影响

温度越高，分子运动速率越大，有机溶剂可以更快速地进入藻细胞内部，使得油脂提取所需的时间减少。但是，提取温度有时会破坏微藻内的有效成分，而且需要考虑提取溶剂的沸点的限制因素[24]。同时较高的温度必然会造成能量的浪费，这也是目前限制微藻能源推广应用的主要制约因素。所以为了使生物柴油具有市场大规模应用所需的条件，同时最大限度地保持微藻内部的活性物质和油脂的品质。本实验所探究的温度条件都在接近常温的条件下进行的，使得在消耗较少能量的同时可以获得尽量高的提取率。实验结果如图3 所示。

实验结果表明，在接近常温时利用有机溶剂溶剂提取微藻油脂，油脂的提取率满足先增后减的总体趋势，在温度为45℃时提取率达到最大值，随后提取率下降。

图3 温度对微藻油脂提取率的影响

2.4 甲醇和石油醚分步提取对提取率的影响

通过上述单种溶剂的实验可知，在选用石油醚作为提取剂，提取温度为45℃，所加入的石油醚和微藻的比为15mL/g，并且加热时间为5h 时，微藻油脂的提取率可以达到最大值为58.71%。但是该提取率仍然较低，在推广应用的过程中就会造成微藻中残余大量的油脂，从而造成能源浪费。为了进一步提高油脂的提取率，研究采用两种溶剂分步作用来进行油脂的提取，本实验采用极性较强的甲醇试剂和极性相对较弱的石油醚来提取微藻油脂。

按液料比为15mL/g 向微藻中加入极性较强的甲醇试剂，在45℃的条件下，加热到指定的时间，充分破坏微藻的细胞膜，之后转移溶剂后加入等量的石油醚溶剂在相同的温度、加热时间，利用油脂与石油醚相容的原理将油脂从细胞内部提取出来。结果得到，微藻油脂的提取率为77.16%，相比于之前的单一有机溶剂，油脂的提取率上升明显。同时，在各个影响油脂提取率的因素中，考虑到温度的来源需要消耗一定的能量，故在规模化的工业应用中应尽量使提取温度接近常温。为了满足这一需求，实验在双溶剂提取时再次选用温度作为单因素进行实验，以寻找在可接受的提取率的范围内的最佳温度，结果如图4 所示。

从图4 可以看出，相比于单种溶剂，在提取剂上选用甲醇和石油醚两种有机溶剂时，不仅仅在各个对应的温度下油脂提取率有了较大幅度的提高，同时微藻在更低的温度下，油脂提取率反而可以达到一个最大的值，即温度为35℃时提取率就能达到87.90%，这不仅使得微藻油脂提取率有了较大的提高，同时使在微藻提取的过程中能量的消耗大幅降低。

图4 改进后温度对于油脂提取率的影响

3 结 论

（1）采用有机溶剂提取微藻油脂的过程中，有机溶剂的种类、温度、液料比、时间对微藻油脂提取率都有着一定的影响，而影响本实验所用微藻的主要因素是温度和液料比，以石油醚作为提取剂，在温度为45℃、液料比为15 mL/g、提取时间为5h 的条件下，微藻油脂的提取率达到最大值为58.71%。

（2）使用一种极性有机溶剂——甲醇、一种非极性溶剂——石油醚作为提取剂分两步对微藻进行处理会使微藻油脂的提取率大大升高，同时所需要的提取温度还可以相应地降低。实验表明，在相同的液料比和提取时间的条件下，实验温度在35℃时微藻油脂的提取率会达到87.90%。

研究结果表明，在一定的温度和料液比的条件下提取微藻油脂，使用甲醇和石油醚作为提取剂，可以得到较高的提取率，同时可以改善了目前微藻油脂提取中有机溶剂有毒、成本高、高耗能等缺点，为微藻油脂的工业化生产提供了一定的科学参考依据。

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