平阳霉素化疗对口腔鳞癌bcl－xl、Bak蛋白表达的影响

张永宽，薛振恂，王兴强，王维玺，荆欢欢

平阳霉素是广泛用于治疗口腔鳞状细胞癌的化疗药物，有效率较高，但也有很多的不良反应。在临床工作中，有的患者接受了大剂量的平阳霉素治疗，但化疗效果却不佳，表现出较强的耐药性。因此，研究平阳霉素对口腔鳞癌化疗的耐药机制，具有很重要的意义。bcl－xl及Bak基因口腔癌中重要的凋亡调控基因，与肿瘤的发生、发展及多耐药性的产生密切相关。本研究检测平阳霉素对口腔鳞癌bcl－xl及Bak蛋白表达水平的影响，探讨平阳霉素对口腔鳞癌化疗的机制。

1 资料与方法

1.1 纳入标准及分组 纳入标准：①接受平阳霉素术前诱导化疗的口腔鳞癌病例；②患者接受平阳霉素化疗前未接受过其他化疗或放疗。

病例分组：按WHO化疗疗效标准分为：①有效组：完全缓解（CR：肿瘤完全消失）和部分缓解（PR：肿瘤最大直径及其最大的垂直横径的乘积缩小50%以上）；②无效组：稳定（SD）：肿瘤两径乘积缩小不足50%或增大不足25%，进展（PD）：肿瘤两径乘积增大超过25%或出现新病灶。无效组作为对照组。

根据上述条件筛选出用药前后的标本蜡块每组均为20对，用药前后的同一患者的蜡块标本为一配对样本。

1.2 一般资料 取自第四军医大学口腔医学院及解放军第150中心医院病理科，共40例。有效组：20 例，其中男 11 例，女 9 例；年龄（54.5±6.4）岁；体质量（61.3±4.0） kg；部位：颊黏膜 1 例，舌部 5 例，牙龈11例，腭部2例，唇部1例；病理分级：Ⅰ级13例，Ⅱ级7例；生长方式：外生型17例，溃疡型3例；临床分期：Ⅰ～Ⅱ期11例，Ⅲ～Ⅳ期9例；给药方式：肌肉注射12例，静脉注射8例；最终剂量（165±60）mg。 无效组：20例，其中男 13例，女 7例；年龄（55.3±5.3）岁；体质量（60.6±6.3） kg；部位：颊黏膜 3例，舌部8例，牙龈6例，腭部3例；病理分级：Ⅰ级11例，Ⅱ级9例；生长方式：外生型15例，浸润型2例，溃疡型3例；临床分期：Ⅰ～Ⅱ期10例，Ⅲ～Ⅳ期10例；给药方式：肌肉注射13例，静脉注射7例；最终剂量（147±63） mg。

1.3 主要试剂与仪器 兔抗人bcl－xl多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；兔抗人Bak多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；免疫组化SABC试剂盒 （武汉博士德生物工程有限公司）；微波炉（格兰仕公司）；石蜡切片机（AO820德国）；光学显微镜 （OLYMPUS日本）；显微照相系统（OLYMPUS 日本）。

1.4 免疫组化染色步骤

1.4.1 bcl－xl染色步骤 按照博士德公司 SABC免疫组化试剂盒的步骤操作：切片经二甲苯脱蜡后梯度乙醇溶液水化，3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶的活性（37℃，10 min），用微波法进行抗原修复（95～100 ℃，15 min）， 自然冷却后 PBS 洗 5 min×3次，用10%正常山羊血清封闭（37℃，20 min），滴加1∶50 的兔抗人 bcl－xl一抗。4℃过夜后 37℃复温 1h，PBS 5 min×3次，然后滴加1∶100的生物素标记二抗（37 ℃，20 min），PBS 洗 5 min×3 次，滴加 1∶100 的辣根过氧化物酶标记链霉卵白素（37℃，20 min），PBS洗5 min×4次，DAB显色剂显色10 min后终止反应，苏木精复染，常规脱水透明，封片。阴性对照：用PBS代替一抗工作液。

1.4.2 BAK染色步骤 按照博士德公司SABC免疫组化试剂盒的步骤操作：切片经二甲苯脱蜡后梯度乙醇溶液水化，3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶的活性 （37℃，10 min）， 胰蛋白酶抗原修复（0.1%，pH 7.8，37 ℃，10 min），PBS 洗 5 min×3 次，用10%正常山羊血清封闭 （37℃，20 min）， 滴加1∶50的兔抗人BAK一抗。4℃过夜后37℃复温1 h，PBS洗5 min×3次，然后滴加1∶100的生物素标记二抗（37 ℃，20 min），PBS 洗 5 min×3 次，滴加 1∶100 的辣根过氧化物酶标记链霉卵白素（37℃，20 min），PBS洗5 min×4次，DAB显色剂显色10 min后终止反应，苏木精复染，常规脱水透明，封片。阴性对照：用PBS代替一抗工作液。

1.5 分析及统计学方法 用显微镜观察结果，随机取五个视野，记数阳性细胞率及染色强度，然后按下列方法计算该切片的积分：阳性细胞比例积分：0～4% ：0，5%～25% ：1，26%～50% ：2，51%～75% ：3，76%～100%：4。染色强度积分：阴性：0，弱阳性：1，中度阳性：2，强阳性：3。记分方法：如一切片中有20%强阳性细胞，35%中度阳性细胞，10%弱阳性细胞，其积分为：阳性率20%时的积分1×强阳性积分3＋阳性率35%时的积分2×中度阳性积分2＋阳性率10%时的积分1×若阳性积分1＝8。每一对数据为一配对资料，用SPSS19.0统计软件进行统计学分析。

2 结 果

2.1 均衡性检验 有效组和无效组患者在年龄、体重、给药方式及总剂量等方面未见显著性差异（P＞0.05）。

2.2 平阳霉素对有效组标本中 bcl－xl、Bak蛋白表达的影响

2.2.1 平阳霉素对 bcl－xl蛋白表达的影响 在治疗前的标本中，bcl－xl蛋白表达强阳性的为9例，中度阳性的为6例，弱阳性为3例，阴性为2例。而治疗后的标本中可见bcl－xl蛋白表达明显降低，中度阳性为10例，弱阳性为6例，阴性为4例。用SPSS19.0进行配对样本t检验后认为具有显著性差异（P＜0.01）。

2.2.2 平阳霉素对Bak蛋白表达的影响 治疗前的标本中，有4例为强阳性，7例为中度阳性，8例为弱阳性，1例为阴性。在治疗后的标本中，有5例为强阳性，9例为中度阳性，4例为弱阳性，2例为阴性。用SPSS19.0进行配对样本t检验，结果为治疗前后无显著性差异（P＞0.05）。

2.3 平阳霉素对无效组标本中 bcl－xl、Bak蛋白表达的影响

2.3.1 平阳霉素对无效组标本中 bcl－xl蛋白表达的影响 在治疗前的标本中，bcl－xl蛋白表达强阳性的为7例，中度阳性的为8例，弱阳性为4例，阴性为1例。而治疗后的标本中强阳性的为6例，中度阳性为10例，弱阳性为2例，阴性为2例。用SPSS19.0进行配对样本t检验，结果认为治疗前后无显著性差异（P＞0.05）。

2.3.2 平阳霉素对无效组标本中Bak蛋白表达的影响 治疗前的标本中，有3例为强阳性，6例为中度阳性，7例为弱阳性，4例为阴性。在治疗后的标本中，有4例为强阳性，8例为中度阳性，5例为弱阳性，3例为阴性。用SPSS19.0进行配对样本t检验，结果认为治疗前后无显著性差异（P＞0.05）。

3 讨 论

bcl－2蛋白家族在调节细胞程序性死亡中起到中枢作用，包括抑制凋亡和促进凋亡成员。抑制凋亡有 bcL－2、bcl－xL、bcl－w、mcl－1，促进凋亡有 Bax、Bak、Bik、Noxa 及 Bim。 bcl－xL 是 bcl－2 基因家族的重要成员，是高度保守的基因，它可通过不同的剪接机制产生两个大小不同、作用相反的mRNA。其中长型 mRNA（bcl－xl）编码 223 个氨基酸残基，比短型mRNA（bcl－xs）编码的氨基酸多63个，而这63个氨基酸与bcl－2蛋白有73%的同源区域，bcl－xl蛋白的功能与bcl－2相似，能与Bax、Bak等蛋白形成异二聚体，中和Bax、Bak的促凋亡作用，从而抑制细胞凋亡。bcl－xl是独立于bcl－2蛋白以外的抑制凋亡的蛋白，与bcl－2蛋白具有拮抗性的表达。bcl－xl在长寿命的正常细胞和肿瘤细胞中表达，有文献报道bcl－xl是口腔鳞癌中表达的主要抑凋亡蛋白［1］。

Bak是bcl－2基因家族Bax亚系的又一促凋亡基因，它编码一个由216个氨基酸残基组成的蛋白质，与 bcl－2 蛋白有 28%的同源性，含有 BH1、BH2、BH3 功能区，BH3 是连接 bcl－2、bcl－xl的部分，被认为是死亡配体，能与bcl－2、bcl－xl结合后影响其下游的信号转导。它能与bcl－2、bcl－xl形成异二聚体，与 bcl－xl聚合的作用更强，从而中和 bcl－2、bclxl的抑凋亡作用， 也能不依赖于与 bcl－2、bcl－xl形成异二聚体的作用而独自发挥促凋亡的作用［2］。

目前有研究表明化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡伴随着bcl－2基因家族表达的改变，通过改变该家族各基因表达的平衡来影响细胞凋亡。Jones等［3］研究发现顺铂诱导的卵巢细胞癌A2780细胞凋亡伴随着Bak蛋白表达水平的上调，Liu等［4］发现用紫杉醇诱导前列腺癌LNCaP细胞的凋亡伴随着bcl－xl mRNA和蛋白表达的下调和Bak蛋白的上调，Christensen等［5］研究凋亡调控机制时用博来霉素作用于肝细胞，发现博来霉素诱导的肝细胞凋亡伴随着 bcl－2、bcl－xl蛋白表达的下调，及 p53、Bak、Bax蛋白表达的上调。Zhao等［6］的研究表明，苦丁茶多酚在体外能显著诱导BcaCD885肿瘤细胞的凋亡，并能上调 caspase－3、caspase－8、caspase－9、Fas/FasL、Bax、p53、p21、E2F1、p73 和 下 调 bcl－2、bclxL、HIAP－1、HIAP－2 基因及蛋白的表达。Luo 等［7］研究二甲双胍对口腔鳞癌的作用时，发现二甲双胍能显著下调bcl－2和bcl－xL蛋白的表达，下调Bax蛋白的表达。

该研究通过对平阳霉素治疗前后的两组口腔鳞状细胞癌标本的免疫组织化学研究，发现有效组中平阳霉素能使口腔鳞癌细胞中bcl－xl蛋白的表达下调，对Bak蛋白的表达没有影响。而对无效组中的bcl－xl、Bak蛋白的表达没有影响。有研究证明bcl－xl的蛋白表达水平和其mRNA水平具有显著的相关性［8］，因此，平阳霉素是否能使 bcl－xl的mRNA的表达也相应下调，尚需进一步研究证明。

bcl－xl能够保护由 p53 介导的肿瘤细胞凋亡［9］。很多细胞凋亡诱发因素能使线粒体外膜断裂，而线粒体外膜的不连续导致细胞色素C由线粒体释放到细胞质，线粒体上的bcl－xl蛋白能阻止细胞色素C的释放，并能使细胞通过阻止线粒体膜的电位下降适应生长因子去除或药物的作用［10］。从而抑制细胞的凋亡。而且bcl－xl蛋白能直接特异性的与细胞色素C结合，bcl－xl蛋白高表达的细胞中的细胞色素C减少。通过阻止细胞质内的细胞色素C的有效性，bcl－xl蛋白能有效地阻止细胞凋亡的发生［11］。有关实验表明：bcl－xl能有效地增强肿瘤对化疗药物的耐受性［12］，有人用反义 bcl－xl核酸下调 bcl－xl的表达，来提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［13］。而本实验的结果表明：平阳霉素在化疗过程中显著地降低了bcl－xl蛋白的表达，可能降低了肿瘤对化疗药物的耐受性，因此导致肿瘤细胞的死亡。

该研究结果表明有效组中平阳霉素能有效地下调bcl－xl蛋白的表达水平，可能诱导了口腔癌细胞的凋亡，是否是平阳霉素对口腔鳞癌化疗的机制之一，还需要进一步研究。

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