温阳通窍中药复方含药血清对C6脑胶质瘤细胞增殖影响的实验研究*

白　雪，李　亮，冯文茹，周　洁（1.天津中医药大学，天津0019；.天津中医药大学第二附属医院，天津00150；.天津市医药科学研究所，天津0000）

·实验研究·

温阳通窍中药复方含药血清对C6脑胶质瘤细胞增殖影响的实验研究*

白雪1，2，李亮2，冯文茹3，周洁2
（1.天津中医药大学，天津300193；2.天津中医药大学第二附属医院，天津300150；3.天津市医药科学研究所，天津300020）

［目的］观察温阳通窍中药复方含药血清对C6脑胶质瘤细胞增殖的影响。［方法］采用MTT法测定样品对体外培养的肿瘤细胞生长的抑制作用，并在药物代谢不同时间（2 h，4 h，6 h）检测不同剂量的温阳通窍中药复方对C6脑胶质瘤细胞的抑制作用，同时进行空白组对照比较。［结果］温阳通窍中药复方对C6细胞的IC50值约为30.29 μg/mL，细胞毒效果欠佳。10%血清浓度下，药物代谢2、4、6 h后，高、低剂量组对C6脑胶质瘤细胞的抑制率分别为30.22%、21.6%、28.3%和32.87%、9.86%、47.98%。［结论］温阳通窍中药复方对C6脑胶质瘤细胞的增殖具有一定抑制作用，但其抑瘤作用不存在时间与剂量依赖关系，这一结果或许与药物在体内代谢、次生活性产物的出现相关。

温阳通窍中药复方；C6脑胶质瘤细胞；增殖

脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤，其发病率占全部颅内肿瘤的40%［1］。生存期短、死亡率高、治疗困难，对人类健康威胁极大。目前脑胶质瘤治疗所坚持的总原则仍然是手术、放疗和化疗［2］，但由于其浸润性生长的生物学特点，使上述治疗手段均难以达到满意疗效，患者中位生存时间平均只有12个月［3］，且骨髓抑制、消化道反应等不良反应多发，很多患者因不能耐受而退出治疗。在我国，中药治疗一直以来具有传统优势，因其较好的安全性和一定的有效性在肿瘤的治疗中十分重要。温阳通窍中药复方由附子、麻黄、桂枝、蜈蚣、鳖甲、黄芪、川芎、当归、泽泻、防己、藁本等药物组成，以整体观念、辨证施治理论为指导，以扶正祛邪、标本兼治为治疗大法，长期临床应用显示其对脑胶质瘤具有一定疗效。为进一步证实其药效，本课题通过抑瘤实验，对其进行评估，并探寻其药理机制。

1　材料与仪器

1.1动物SPF级SD大鼠，21只，雄性，体质量（220-240）g（中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所，动物许可证号SCXK-（军）2009-007，动物合格证号0001506）。

1.2瘤株大鼠脑胶质瘤C6细胞（天津市医科大学总医院惠赠）。

1.3待测样品温阳通窍中药复方（天津中医药大学第二附属医院药剂科提供；煎药：600g生药得浸膏175g，4℃冰箱保存）。

1.4试剂二甲基亚砜分析纯（天津市化学试剂六厂，批号20070428）；培养基DMEM/F12（GIBCO公司，批号1285082）；MTT（北京欣经科生物技术有限公司，批号T15051/15181）；胎牛血清（GIBCO公司，批号348555）。

1.5仪器CO2孵育箱（TyTe公司，型号C-2021）；内热蒸汽消毒器（山东新华医疗器械厂，型号yxQG02）；台式离心机（北京医用离心机厂，型号LD4-2）；酶标仪（Labsystems Dragon公司芬兰产，型号353）；96孔板（Greinerbio-one，No.655180）；倒置显微镜（OLYMPUS，日本产）。

2　MTT法测定样品对体外培养的肿瘤细胞生长的抑制作用

2.1样品的配制精密称取样品适量，加入含10%牛血清的营养液中，制备成浓度为500 g/L的混悬液，再依次倍比稀释成10个浓度（实验时根据结果情况调整样品的配置浓度）。

2.2方法实验采用常规MTT检测方法。取对数生长期细胞，经胰酶消化后加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，将细胞稀释成单细胞悬液，调整细胞数，接种于96孔板，100 μL/孔。将接种后的细胞置37℃二氧化碳培养箱内培养24 h细胞贴壁后加样品，将样品用DMEM/F12培养液进行倍比稀释。于96孔板中分别加入不同浓度待测样品液，100 μL/孔加入样品。实验样品设250～0.488 g/L 10个浓度。每个浓度设4个复孔，对照设8个以上复孔。加样后仍将细胞置37℃二氧化碳培养箱内继续培养72 h，然后加MTT。MTT5 g/L，每孔加10 μL。37℃继续培养4 h后取出，每孔加入DMSO 150 μL，在酶标仪570 nm测定OD值。

2.3评价指标细胞生长抑制率IC50，抑制率=（1-实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%，以直线回归方法计算IC50。

3　观察温阳通窍方含药血清对体外培养的大鼠脑胶质瘤增殖的影响

3.1分组SD大鼠21只，采用随机数字表法，分成7组，即正常对照组、温阳通窍中药复方高剂量组（26 g/kg）、温阳通窍中药复方低剂量组（13 g/kg），其中高剂量组和低剂量组各分3组分别为2 h采血组、4 h采血组和6 h采血组。

3.2给药配制高剂量组1.5 g/mL浸膏和低剂量组0.75 g/mL浸膏。除正常对照组给予蒸馏水外，其他各组均给以相应受试药，每日2次，0.5 mL/100 g，连续给药7次。

3.3含药血清的制备末次给药后2、4、6 h，腹主动脉取血，室温放置1 h后，离心分离血清，取上清液，同组动物血清等量混合，经56℃，30 min灭活后，-20℃冻存备用。

3.4方法取体外培养C6细胞，胰酶消化，用DMEM/F12培养液稀释成1.5×104个/mL单细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100 μL，每组设4个复孔。加入含药血清培养液100 μL/孔，使终浓度为10%、20%，同时做相同浓度的正常鼠血清作为对照组，37℃，5%CO2孵育箱培养72 h后加入5 g/L MTT 10μL，作用4h，弃去培养液，加入DMSO150 μL，轻轻摇动培养板，应用酶标仪检测570nm波长处的0D值。

3.5统计学方法应用SPSS18.0 for windows软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间差异比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnett’s T3法，P＜0.05为差异有统计学意义。

4　结果

本实验采用MTT法对温阳通窍中药复方的细胞毒性进行分析。由表1得出温阳通窍中药对C6细胞的IC50值约为30.29 μg/mL，细胞毒效果欠佳。而表2可见末次给药后经药物代谢2、4、6 h后制备含药血清，将用量为10%、20%血清分别作用于高剂量组、低剂量组及对照组的C6细胞，观察其细胞毒性。结果发现：10%血清浓度下，高剂量组血清样本在不同时间对C6脑胶质瘤的抑制率分别为30.22%、21.6%、28.3%，具有统计学意义（P均＜0.05）。而低剂量组血清样本在不同时间对C6脑胶质瘤的抑制率分别为32.87%、9.86%、47.98%，在2 h与6 h间具有统计学意义（P＜0.05），且作用6 h后效果最佳（P＜0.01）。

表1　温阳通窍复方对C6细胞生长作用的影响（±s）Tab.1　The influence of Wenyang Tongqiao prescription to the growth of C6 glioma（±s）

表1　温阳通窍复方对C6细胞生长作用的影响（±s）Tab.1　The influence of Wenyang Tongqiao prescription to the growth of C6 glioma（±s）

药物浓度（g/L）62.5 31.25 15.625 07.8125 03.906 01.953 00.977 00.488 IC50OD值0.146±0.019 0.159±0.030 0.291±0.015 0.355±0.015 0.386±0.026 0.385±0.028 0.403±0.014 0.400±0.015 30.29

表2　温阳通窍中药复方抑制C6胶质瘤细胞的增殖（±s）Tab.2　Wenyang Tongqiao prescription restrain the growth of C6 glioma（±s）

表2　温阳通窍中药复方抑制C6胶质瘤细胞的增殖（±s）Tab.2　Wenyang Tongqiao prescription restrain the growth of C6 glioma（±s）

注：与10%血清浓度大鼠血清对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.001

组别OD值抑制率10%20%10%20%牛血清对照0.540±0.013大鼠血清对照0.847±0.0950.887±0.135高剂量2 h0.591±0.119*0.868±0.06230.22%02.41%高剂量4 h0.664±0.066*0.701±0.07421.60%21.05%高剂量6 h0.607±0.159*0.682±0.09028.30%23.16%低剂量2 h0.569±0.059*0.831±0.14332.87%06.28%低剂量4 h0.764±0.1170.856±0.13509.86%03.49%低剂量6 h0.441±0.029**0.742±0.14947.98%16.30%

5　讨论

恶性肿瘤的发生是人体内部功能平衡失调以致外邪入侵的复杂病理过程和必然结果。中国医学虽未明确记载脑瘤病名，但古医籍中所言之“厥逆”、“真头痛”、“头风”等症状或体征均与现代医学的脑瘤类似。《灵枢·厥病篇》记载:“真头痛，头痛甚，脑尽痛，手足寒至节，死不治。”《灵枢·大惑论》云：“故邪中于项，因逢其身虚，……入于脑则脑转。脑转则引目系急，目系急则目眩以转矣。”《素问·至真要大论》记载：“头项囟顶脑户中痛，目如脱。”《中藏经》明确地指出：“头目久痛，卒视不明者，死。”这与胶质瘤的临床表现及预后非常相似。胶质瘤的病位虽然在脑，但与肝、脾、肾等脏腑有关，痰、瘀、毒、虚为其主要的病理因素。其发病机制有多环节参与，但单纯用“气滞血瘀”、“痰浊阻滞”、“气血凝滞”、“毒邪郁结”、“气阴两虚”的病机理论尚不能完全解释对恶性肿瘤中医药治疗难以收效的临床现实。《素问·生气通天论》云：“阳气者，若天与日，失其所则折寿而不彰。”《灵枢·百病始生篇》云：“积之始生，得寒乃生，厥乃成积矣。”回顾传统中医古籍关于“癥瘕积聚”发病的认识，“寒凝血瘀”为其主要病机。

温阳通窍中药复方是本课题组治疗脑胶质瘤的经验方［4］。方中附子为君药，其性辛、甘，大热，有大毒，其性刚雄，通行十二经，温五脏之阳，具有回阳救逆，祛风除湿，散寒止痛等功效，《本草经读》：“附子，味辛气温，火性迅发，无所不到，故为回阳救逆第一品药。”方中麻黄、桂枝配伍，麻黄辛温气薄，善行肌表卫分，桂枝色赤入营，善于解肌和营，二者并重，意在取风药辛温之性，能畅达阳气，振奋人体气化功能，使气血运行，血脉通畅，则阴霾得以消散。蜈蚣、鳖甲为臣药，蜈蚣辛温，性善走窜，内而脏腑，外而经络，凡气血凝聚之处皆能开之；鳖甲，其性咸平，主消散，平亦辛也，咸能软坚，辛能走散，作为血肉有情之品，善于活血软坚散结，与川芎、当归等相配伍，则作用更强。黄芪甘温大补脾气；川芎味辛性温，祛风散寒止痛，且又辛香走窜，可上通巅顶，下达气海，祛瘀通络，善入肝经，行气中之血；当归暖中祛寒，润养补虚，既可防诸药辛燥，又能生血化阴，血为气母，三者相合，气血双补，为佐药。泽泻泻肾邪，养五脏，益气力，起阴气，补虚损；防己大辛苦寒，通行十二经，开窍泻湿，走而不守者，领诸药环转于周身，使上行下出，外通内达，用黄芪助卫气于外，麻黄、桂枝通行营卫，使防己大彰其效。藁本为太阳经风药，其气雄壮，祛风散寒、胜湿止痛，善达巅顶，引诸药上行。诸药共奏温阳化痰、活血通络、软坚散结之功。经临床及初步研究表明，温阳通窍复方可使肿瘤细胞的损伤加重，导致细胞坏死凋亡［5］。现代药理证明，温阳药通过直接抑制或杀灭肿瘤细胞、诱导肿瘤细胞分化和凋亡、逆转肿瘤细胞的生物学行为改变，提高患者的生活质量［6］。适当浓度附子多糖能够在体外有效诱导肝癌患者外周血单核细胞分化为树突状细胞并表达成熟表型，从而作为第二信号活化T淋巴细胞，激发肿瘤免疫［7］。对胃癌细胞SGC-7901的增殖抑制作用也具有明显的浓度和时间依赖性［8］。曹桂芬［9］等通过体外实验发现桂皮醛对人口腔鳞状细胞癌细胞增殖具有明显的抑制作用，且与质量浓度和作用时间有关，在一定程度上肯定了桂皮醛的抗肿瘤作用。刘兵［10］等发现少棘蜈蚣活性蛋白对舌癌Tea-8113细胞增殖的抑制作用呈现明显的量效及时间依赖关系，有一定的体外抗肿瘤活性。张秋菊等［11］认为黄芪通过阻滞肿瘤细胞增殖周期、影响细胞凋亡信号转导途径、调控癌基因和抑癌基因的表达等途径致细胞凋亡以达到抗肿瘤的目的。通过MTT法研究发现，川芎多糖在62.5～1 000 μg/mL的剂量范围内，能明显抑制人肝癌HepG2细胞的增殖，且呈现出一定的剂量依赖性，其IC50为677.5 μg/mL［12］。藁本内酯对癌细胞L1210、K562具有很强抑制作用，IC50分别为（2.27± 0.10）、（4.78±0.18）μmol/L［13］。研究显示，藁本内酯主要是通过抑制细胞增殖而非细胞毒素实现的抗癌作用，对肠癌细胞HT-29抑制作用IC50为（60.63± 6.7）μmol/L，要强于对正常结肠细胞CCD-18Co细胞毒作用［14］。

MTT比色法简单、灵敏、可重复性好，现已被广泛用于体外肿瘤药敏的测定。本实验应用MTT法测定温阳通窍中药复方对C6脑胶质瘤细胞增殖抑制的实验表明，温阳通窍中药复方本身可能对C6细胞的细胞毒效果欠佳。但经药物代谢后对C6脑胶质瘤细胞增殖发挥抑制作用，但根据不同取血时间点所获取的含药血清显示出不同的抑制肿瘤细胞增殖的效果来看，其抑瘤作用不存在时间与剂量依赖关系。

体外法快速、简便，具有一定可重复性和临床相关性，同时也存在一定缺陷，如体外培养条件与体内细胞生长环境之间存在着不同程度的差异，体外杀伤作用只能相对反映体内的毒性情况等.因此体内外疗效相关性的研究、试验中对药物浓度的选择等相关实验，还应更加深入进行。实验结果初步证明，温阳通窍中药复方对C6脑胶质瘤细胞的增殖具有一定抑制作用，这一结果或许与药物在体内代谢、次生活性产物的出现相关［15］。这也体现了中药需制剂复杂性的特点，为今后临床使用提供依据，值得在未来的研究中进一步探讨。

［1］Ohgaki H.Epidemiology of Brain Tumors［J］.Methods Mol Biol，2009，472:323.

［2］《中国中枢神经系统胶质瘤诊断和治疗指南》编写组.中国中枢神经系统胶质瘤诊断和治疗指南（简化版）［J］.中华医学杂志，2012，92（33）:2309-2312.

［3］Jansen M，Yip S，Louis DN.Molecular pathology in adult gliomas: diagnostic，prognostic，and predictive markers［J］.Lancet Neurol，2010，9（7）:717-26.

［4］周洁，刘海晔，赵美蓉.脑瘤散治疗复发性脑胶质瘤的临床研究［J］.天津中医药，2008，25（4）:277-280.

［5］李竹庭，周洁，刘海晔.脑瘤散对脑胶质瘤细胞GFAP及Bax/ Bcl-2的影响［J］.天津中医药，2013，06:356-358.

［6］叶峥嵘，杨晓航，吴琳.温阳法治疗肿瘤的临床应用与基础研究进展［J］.陕西中医学院学报，2011，34（1）:88-91.

［7］高林林，曾升平，潘力弢.附子多糖诱导肝癌患者外周血树突状细胞分化成熟的实验研究［J］.中国肿瘤临床，2012，39（13）：882-885，894.

［8］张晓迪，吴酉霆.附子提取物抗胃癌SGC-7901细胞增殖及诱导癌细胞凋亡实验研究［J］.浙江中医药大学学报，2011，35（5）:665-668.

［9］曹桂芬，谢萍，黄萍，等.桂皮醛对口腔鳞状细胞癌细胞抑制作用的体外研究［J］.国际口腔医学杂志，2013，40（1）:10-13.

［10］刘兵，谭竹钧，孔祥平，等.少棘蜈蚣活性蛋白对舌癌细胞Tea-8113的抑制作用研究［J］.时珍国医国药，2013，18（6）:1543-1544.

［11］张秋菊，刘斌.基于细胞凋亡机制的黄芪抗肿瘤作用研究进展［J］.中国老年学杂志，2013，33（11）:2729-2731.

［12］王景春，刘蔚，杨瑞玲，等.川芎多糖对人肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响［J］.南京中医药大学学报，2014，30（5）:461-464.

［13］Chen QC，Lee J，Jin W，et a.Cytotoxic constituents from angelicae sinensis radix［J］.Arch Pharm Res，2007，30（5）:565.

［14］Kan W L，Cho C H，Rudd J A，et al.Study of the anti-proliferative effects and synergy of phthalides from Angelica sinensis on colon cancer cells［J］.J Ethnopharmacol，2008，120（1）：36.

［15］柯玮，朱建华.中药血清药理方法学的研究概况［J］.中国医药指南，2011，9（6）:24-25.

（本文编辑：高杉，张震之）

The experimental study on the impact that secrum has Wenyang Tongqiao prescription on C6 glioma proliferation

BAI Xue1，2，LI Liang2，FENG Wen-ru3，ZHOU Jie2
（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300150，China；3.Tianjin Institute of Medical Science，Tianjin 300020，China）

［Objective］Inspect the impact that secrum has Wenyang Tongqiao prescription on C6 glioma proliferation.［Methods］Utilize MTT to determine the inhibition effect that the sample has to the grow of tumor cell cultivated in vitro，and to determine the inhibition effect that the different dosages of Wenyang Tongqiao prescription of traditiond Chinese medicinef（TCM）have to C6 glioma in different times of drug metabolism（2 h，4 h，6 h），at the same time，comparing the blank control group.［Results］IC50of Wenyang Tongqiao prescription that impact on the C6 glioma is 30.29 μg/mL approximately and has less cytotoxic effect.Under the 10%concentration secrum，drug metabolism after 2 h，4 h，6 h，the inhibition rates that the high and low dosages to C6 glioma are 30.22%，21.6%，28.3%and 32.87%，9.86%，47.98%.［Conclusion］Wenyang Tongqiao prescription has certain inhibitory effect on C6 glioma proliferation，but this effect has no relationship with time and dosages，this result perhaps has a relationship with the drug metabolism and the secondary active products.

Wenyang Tongqiao prescription；C6 glioma；proliferation

R285.5

A

1672-1519（2015）05-0282-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.05.08

天津市科技计划项目（11JCYBJC12500）；天津市中医药管理局、中西医结合科研专项课题（13085）。

白雪（1983-），女，医学博士，主治医师，从事中西医治疗肿瘤方面研究。

周洁，E-mail:cnzhoujie@126.com。

（2015-01-12）