心复康协同骨髓间充质干细胞上调心脏干细胞GATA4和Cx43 mRNA的表达

王一婧，索艳荣，曾文赟，阚伯红，姜希娟，范英昌（.天津中医药大学，天津30093；.天津中医药大学第一附属医院，天津30093）

心复康协同骨髓间充质干细胞上调心脏干细胞GATA4和Cx43 mRNA的表达

王一婧1，索艳荣1，曾文赟1，阚伯红2，姜希娟1，范英昌1
（1.天津中医药大学，天津300193；2.天津中医药大学第一附属医院，天津300193）

［目的］观察心复康协同骨髓间充质干细胞（BMSC）对心脏干细胞（CSC）GATA4和Cx43 mRNA表达的调节。［方法］采用全骨髓贴壁法获得BMSC，并对其进行流式细胞鉴定。制备心复康含药血清，高效液相色谱分析其成分，并作用于细胞共培养体系，采用实时定量PCR法检测各组CSC中GATA4和Cx43 mRNA的表达。［结果］相较于其他两组，心复康组CSC中的GATA4和Cx43 mRNA表达明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。［结论］心复康协同BMSC能够上调CSC中GATA4和Cx43 mRNA的表达。

心复康；骨髓间充质干细胞；心脏干细胞；GATA结合蛋白4；缝隙连接蛋白43

传统观念认为，人体出生后心肌细胞已永久性地退出细胞分裂周期［1］，当心肌缺血损伤后，心肌细胞仅能发生肥大。但近年来研究发现，成体心脏中存在提交心肌谱系的多能干细胞，即心脏干细胞［2］（CSC）。生理条件下，CSC长期处于静止状态，一旦发生缺血性心脏病，CSC分裂功能可被激活［3］，并增生分化为心肌细胞、内皮细胞等。由于CSC向心肌细胞分化能力弱，使其难以发挥代偿作用。因此，如何促进CSC向心肌细胞分化成为研究热点。

由于具有取材便易、扩增能力强且免疫原性低的优势［4］，骨髓间充质干细胞（BMSC）被认为是治疗心肌细胞丢失的重要种子细胞［5］。移植BMSC可通过促进心脏微血管和心肌细胞生成，从而改善心功能［6］。然而，近期研究发现，直接通过自身的转分化作用并非BMSC发挥修复作用的主要机制。BMSC在激活内源性干细胞的自我更新和分化潜能中发挥更为重要的作用，而在心肌组织其可干预的重要内源性干细胞即为CSC。尽管BMSC可协同CSC向心肌细胞分化，心肌缺血微环境却明显抑制了两者的作用效果。

临床观察和前期研究显示，益气养阴、活血化瘀中药复方心复康对改善心肌缺血微环境和提高缺血心肌心功能效果显著［7］。因此假定心复康可协同BMSC促进CSC向心肌样细胞分化，并从观察心复康含药血清能否协助BMSC上调CSC向心肌样细胞分化的基因GATA4和Cx43的mRNA表达入手，体外验证上述假说。

1　材料

1.1实验动物8周龄C57小鼠10只，体质量（20±1）g，雄性。5月龄家兔4只，体质量（2.5±0.1）kg，雄性。均由北京华阜康生物科技公司提供。

1.2实验细胞C57小鼠CSC，由美国西北大学医学院芬伯格心血管研究所覃刚健教授惠赠。

1.3主要试剂DMEM（Gibco），DMEM/F12（Gibco），胎牛血清（Hyclone），PE标记的抗CD34抗体及同型对照抗体（Santa Cruz Biotech），PE标记的抗CD45抗体及同型对照抗体（Biolegend），FITC标记的抗CD90及同型对照抗体（Ebioscience），FITC标记的抗CD29及同型对照抗体（Ebioscience），Fasline Cell cDNA Kit（天根），q-PCR试剂盒（北京康为世纪），PCR引物系列（北京华大科技）。

1.4主要仪器流式细胞分选仪（BD，美国），高效液相色谱仪（岛津，日本），LightCycle 480实时荧光PCR系统（Roch，瑞士），AG22331梯度PCR仪（Eppendorf，德国）。

2　方法

2.1BMSC培养麻醉后处死C57小鼠，消毒，取股、胫骨，暴露髓腔。用DMEM反复冲洗髓腔，以100目筛网过滤冲洗液，800 r/min离心5 min，收集细胞。以含10%FBS的DMEM完全培养基重悬细胞，镜下计数，以密度1×105个/mL接种于25 cm2培养瓶。48 h后首次换液，此后每3 d换液1次，待细胞融合度为80%时传代，选用第3～4代细胞进行后续实验。

2.2流式细胞鉴定对所获的BMSC以抗CD29、CD90、CD34和CD45抗体进行表面标记，其中CD29和CD90为BMSCs特征表面标记物，CD34和CD45为造血细胞标记物，流式细胞仪测定。

2.3心复康含药血清制备、鉴定

2.3.1心复康成分西洋参15 g，白术15 g，枸杞子15 g，女贞子10 g，鹿衔草10 g，昆布10 g，降香10 g。

2.3.2心复康含药血清制备根据人与兔体表面积折算等效剂量，制备心复康中药水煎剂，采用旋转蒸发仪浓缩，每只每天灌胃1次，对照组给予等量生理盐水。连续灌胃7 d，于末次灌胃2 h后，采用心脏直接取血法，制备无菌兔血清，于-20℃保存。

2.3.3心复康含药血清鉴定心复康君药为西洋参，以人参皂苷Re为代表，对所得空白血清和含药血清进行高效液相色谱分析。

2.4实验分组包括单细胞组、共培养组及心复康组。各组均接种CSC于transwell小室内，密度为1×105/mL，以含10%FBS的DF12全培培养。单细胞组下室仅加BMSC全培，共培养组与心复康组下室均接种BMSC（密度为1×105/mL）。24 h后换液，在各组细胞的全培基础上，单细胞组与共培养组的小室上下各加5%对照血清，心复康组的小室上下各加5%含药血清，培养72 h后进行检测。

2.5GATA4和Cx43 mRNA表达的测定按照试剂说明书步骤制备细胞cDNA，用于后续荧光定量PCR检测。实验数据根据目的基因和内参基因各自的Ct值，采用2-ΔΔCt法计算各样品中目的基因相对表达量，见表1。

表1　基因引物序列及目标产物大小Tab.1　Gene primer sequences

2.6数据统计与分析采用SPSS 19.0统计学软件处理数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义，统计作图采用Origin 8.0软件。

3　结果

3.1BMSC培养结果接种24 h后可见细胞贴壁生长，大部分呈梭形、纺锤形，少数呈三角形。原代培养3 d后，细胞集落样生长，增殖加快，约14 d后细胞可铺满瓶底。首次传代需严格控制消化时间，按1:2比例接种，传代后细胞形态表现更为一致，见图1。

图1　BMSCs原代及传代后生长情况Fig.1　The growth condition of BMSCs after primary and passage culture

3.2BMSC流式鉴定结果流式细胞仪分析显示：BMSC特征表面标记物表达比率高，分别为CD29（95.75%±1.32%）、CD90（92.29%±0.76%）；造血细胞标记物表达比率低，分别为CD34（3.9%±0.31%）、CD45（5.24%±0.42%）。表明此培养方法所得BMSC纯度较高，能够满足后续实验要求。

3.3心复康含药血清鉴定结果含药血清组在24.142 min时出现的峰值与人参皂苷Re对照峰相符，而空白血清在此时间段无峰值出现。表明所制含药血清已含有中药代谢成分，符合后续实验要求，见图2。

3.4心复康协同BMSC对CSC中的GATA4和Cx43 mRNA表达的影响荧光定量PCR结果显示：相较于单细胞组（CSC组）与共培养组（CSC+ BMSC），心复康组（CSC+BMSC+XFK）中CSC的GATA4和Cx43 mRNA表达明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

4　讨论

GATA结合蛋白4（GATA binding protein 4，GATA4）是心肌细胞内含量丰富的组织特异性转录因子，其在心脏早期发育过程中起着至关重要的作用，尤其对于调控编码心肌特异性蛋白的诸多基因［8］。研究表明GATA4可诱导干细胞分化为心肌细胞，且GATA4是心肌祖细胞的最早期信号［9］，在心脏发育早期的中胚层就有所表达［10］。典型的心肌转录因子GATA4，在心肌细胞的发育成熟期，对于调节细胞系分化的核转录过程发挥重要作用［11］。

在各类动物组织中，相邻细胞的接触区域存在广泛的间隙连接，其由多个蛋白组成，它们共同构成细胞间隙连接通讯通道。在胚胎发育过程中，通过间隙连接的组织间信号传播有助于细胞的迁移和分化［12］，间隙连接在建立心肌细胞间电化学通讯中起到至关重要的作用［13］，在心脏发育过程中，3种主要的心脏间隙连接Cx（connexin）基因Cx40、Cx43或Cx45的不足易导致严重的心脏畸形［14，15］。Cx43在心肌细胞分化过程中是作为工作心肌的主要间隙连接蛋白，直接牵涉到心肌细胞信号的转移［16］。

某些中药复方制剂能有效诱导干细胞增殖、分化，并具有毒副作用小的优势［17］。心复康源于中医名家阮士怡之手，是基于中医理论所设。心肌梗死分属于中医学“胸痹”、“真心痛”等范畴。中医学认为该病病位在心，与脾（胃）、肾、肝（胆）等多脏腑相关，呈现本虚标实的病理特征［18］。本虚又以气虚为主，标实以血瘀最为突出，因此益气活血法成为治疗心梗的重要治法［19］。西洋参和白术具有益气的功效，枸杞子和女贞子具有补益肝肾的功效，鹿衔草和降香具有活血止血之功效，昆布有软坚散结、消痰和利水的功效。该复方在临床应用普遍，对于气滞血瘀型胸痹效果较好，尤其在改善患者胸闷憋气症状，提高心功能方面有独到疗效。

图2　高效液相色谱图Fig.2　The figure of high performance liquid chromatography

图3　各组CSC的GATA4与Cx43 mRNA相对表达量Fig.3　The GATA4 and Cx43 mRNA expression of CSC in each group

本研究显示心复康协同骨髓间充质干细胞可以上调心脏干细胞的GATA4和Cx43 mRNA的表达，提示两者具有促进心脏干细胞向心肌样细胞分化的潜能，为临床通过药物干预，提高干细胞移植效果提供了实验依据。

［1］Soonpaa MH，Field LJ.Survey of studies examining mammalian cardiomyocyte DNA synthesis［J］.Circulation Research，1998，83（1）: 15-26.

［2］Beltrami AP，Barlucchi L，Torella D，et al.Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration［J］.Cell，2003，114（6）:763-776.

［3］Anversa P，Kajstura J，Leri A，et al.Life and death of cardiac stem cells:a paradigm shift in cardiac biology［J］.Circulation，2006，113（11）:1451-1463.

［4］孙连胜，徐秀梅，郭茂娟，等.丹酚酸B体外干预骨髓间充质干细胞分化过程中cTnT的表达［J］.天津中医药，2007，24（4）:318-320.

［5］崔洁，范英昌，薛亮.大鼠MSCs的体外分离、培养及鉴定的实验研究［J］.天津中医药，2012，29（5）:463-464.

［6］华声瑜，赵桂峰，李庆雯，等.丹酚酸B预处理EPCs对AMI大鼠移植骨髓间充质干细胞后心肌微环境的影响［J］.天津中医药，2012，29（2）:117-120.

［7］范英昌，华声瑜，李广斌，等.中药干预骨髓基质细胞移植心肌再生的研究［J］.天津中医药，2008，25（1）:65.

［8］Ghatpande S，Brand T，Zile M，Evans T.Bmp2 and Gata4 function additively to rescue heart tube development in the absence of retinoids［J］.Developmental Dynamics，2006，235（8）:2030-2039.

［9］Snyder M，Huang XY and Zhang JJ.Stat3 directly controls the expression of Tbx5，Nkx2.5，and GATA4 and is essential for cardiomyocyte differentiation of P19CL6 cells［J］.Biological Chemistry，2010，285（31）:23639-23646.

［10］Gao XY，Tan YZ，Wang HJ.Overexpression of Csx/Nkx2.5 and GATA-4 Enhances the Efficacy of Mesenchymal Stem Cell Transplantation After Myocardial Infarction［J］.Circulation，2011，75（11）:2683-2691.

［11］Fujiura J，Yamato E，Yonemura S.Differentiation of embryonic stem cells is induced by GATA factors［J］.Genes and Development，2002，16（7）:784-789.

［12］Levin M.Gap junctional communication in morphogenesis［J］. Progress in Biophysics and Molecular Biology，2007，94（1）:186-206.

［13］Maeda S，Tsukihara T.Structure of the gap junction channel and its implications for its biological functions［J］.Cellular and Molecular Life Sciences，2011，68（7）:1115-1129.

［14］Kumai M，Nishii K，Nakamura K，et al.Loss of connexin45 causes a cushion defect in early cardiogenesis［J］.Development，2000，127（16）: 3501-3512.

［15］Kirchhoff S，Kim JS，Hagendorff A，et al.Abnormal cardiac conduction and morphogenesis in connexin40 and connexin43 double-deficient mice［J］.Circulation Research，2000，87（5）:399-405.

［16］Ramkisoensing AA，Pijnappels DA，Swildens J，et al.Gap Junctional Coupling with Cardiomyocytes Is Necessary but Not Sufficient for Cardiomyogenic Differentiation of Cocultured Human Mesenchymal Stem Cells［J］.Stem Cells，2012，30（6）:1236-1245.

［17］李广斌，苏金玲，姜希娟，等.心复康联合骨髓间充质干细胞移植对濒死心肌的保护作用［J］.天津中医药，2010，27（2）:147-149.

［18］高宇，张军平，阮士怡.阮士怡教授治疗冠心病临证经验［J］.天津中医药，2011，28（1）:5-6.

［19］马文礼，郭茂娟，华声瑜.心复康对心肌梗死大鼠心室重塑促血管生成的影响［J］.天津中医药，2007，26（3）:137-139.

（本文编辑：马英，张震之）

The synergy between Xinfukang and Bone marrow mesenchymal stem cells increases the expression of GATA4 and Cx43 in cardiac stem cells

WANG Yi-jing1，SUO Yan-rong1，ZENG Wen-yun1，KAN Bo-hong2，JIANG Xi-juan1，FAN Ying-chang1
（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.The First Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To observe the synergy effects between Xinfukang and Bone marrow mesenchymal stem cells（BMSC）in the expression of GATA4 and Cx43 in Cardiac stem cells（CSC）.［Methods］BMSC were obtaining by the whole bone marrow adherent method，and the purity was evaluated by flow cytometry.Xinfukang convalescent serum were analyzed through high performance liquid chromatography（HPLC），and then used for cell co-culture system.Real-time quantitative PCR were used to detect the expression of GATA4 and Cx43 in groups of CSC.［Results］GATA4 and Cx43 in the Xinfukang group were increased significantly（P＜0.05）.［Conclusion］Xinfukang collaborative with BMSC can increase the expression of GATA4 and Cx43in CSC.

Xinfukang；bone marrow mesenchymal stem cell；cardiac stem cell；GATA4；Cx43

R285.5

A

1672-1519（2015）05-0291-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.05.10

国家自然科学基金项目（81173413）。

王一婧（1986-），女，博士研究生，主要从事中医药干预心脑血管疾病的研究。

范英昌，E-mail：fych@tjutcm.edu.cn。

（2014-12-18）