一株野生酿酒酵母的分离鉴定及发酵分析

阎贺静，时 月，刘 畅，李润丰（河北科技师范学院 食品科技学院，河北 昌黎 066600）

一株野生酿酒酵母的分离鉴定及发酵分析

阎贺静，时 月，刘 畅，李润丰
（河北科技师范学院 食品科技学院，河北 昌黎 066600）

本试验从玫瑰香葡萄酒自然酿造过程中筛选分离出一株野生酵母菌，经菌落形态观察及分子生物学鉴定为酿酒酵母，命名为Yeast1。对Yeast1进行乙醇耐受性分析，发现Yeast1能够耐受16%（v/v）的酒精度。Yeast1发酵葡萄汁结束后，残糖量、酒精度、挥发酸、总酯和总酸含量分别为3.627 011 g/L、8.5%、0.210 84 g/L、1.264 4 g/L和4.160 3 g/L，分析表明Yeast1发酵力强、速度快、酒精产量较高，残糖量符合酿造干型酒的要求，满足正常的发酵需要。此外，从Yeast1葡萄汁发酵液中共检测到50种香气成分，其中醇类18种、酯类13种、醛类7种、其他酸烯酮醚等物质12种。研究结果表明，昌黎产地玫瑰香葡萄自然酿造中存在较好性能的天然酵母，若将其合理利用可能会酿造出更优质、更具特色的葡萄酒。

玫瑰香葡萄酒；野生酵母；分离；鉴定；发酵分析

葡萄酒的风味物质主要来自于葡萄和酵母酒精发酵过程。优质的葡萄酒应该具有突出的地域特色和品种香气。据文献［1］报道，不同生态因子和不同酵母菌种对地域特色葡萄酒的风格形成有重要影响。由传统葡萄和葡萄酒产区分离获得的酿酒酵母具有产区地域特色，对于酿制地域特色葡萄酒是非常有必要的。

酵母菌是葡萄酒酿造的生命之源，葡萄酒的品质与其有着密不可分的关系。很多研究工作者和葡萄酒生产商都在从事特色产区酵母的选育工作，以获得良好的菌种，酿造具有地域风格和典型性的优质葡萄酒［2-4］。昌黎是我国主要的玫瑰香葡萄产地之一，由玫瑰香酿造的玫瑰型葡萄酒口味清爽优雅，具有迷人的玫瑰香气，果味突出，具有明显的品种特征。为了酿制具有地域特色和品种香气的优质玫瑰香葡萄酒，使用产区分离获得的酵母非常有必要。本研究拟从玫瑰香葡萄酒自然酿造过程中分离优势酵母，并对其发酵特性进行分析，确定其葡萄酒酿造特性，为具有产地和品质特色的玫瑰香葡萄酒酿造提供适宜的酵母种质资源。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

试验中所用玫瑰香葡萄采摘自河北省昌黎县葡萄沟，葡萄样品去除生青、霉烂果和枯枝烂叶后，去除果梗、用手破碎用于葡萄酒的自然发酵。其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器设备

SW-CJ-2D型净化工作台:苏州净化设备有限公司；SPX-250B-Z型生化培养箱:上海博迅实业有限公司医疗设备厂；YXQ-LS-50S11立式压力蒸汽灭菌锅:上海博迅实业有限公司医疗设备厂；HZQ-C空气浴振荡器:哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；OLYMPUS显微镜CX319:日本奥林巴斯公司；V1型全自动菌落计数仪:杭州迅数科技有限公司；PCR扩增仪（TaKaRa Thermal Cycler Dice TP600，TaKaRa BIO INC）；ImageMster VDS电泳成像装置（Pharmacia Biotech）；ABI PRISMTM3730XL DNA Sequencer DNA测序仪（Applied Biosystem）。

1.3 培养基

培养基配置中用水均为蒸馏水。

1.3.1 YPD培养基 葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，YEPD固体培养基中添加琼脂20 g/L。（在以上两种培养基即YPD和YEPD中分别加入100 mg/L氨苄青霉素抑制细菌生长）。

1.3.2 WL培养基 葡萄糖50 g/L，琼脂20 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母浸粉4 g/L，磷酸二氢钾0.55 g/L，氯化钾0.425 g/L，氯化钙0.125 g/L，硫酸镁0.125 g/L，氯化铁0.025 g/L，硫酸锰0.002 5 g/L，溴甲酚绿0.022 g/L，调pH值至6.0。

1.3.3 豆芽汁培养基 将10%的鲜豆芽煮沸30 min，过滤后取清液添加葡萄糖50 g/L，自然pH。

1.3.4 PDA培养基 马铃薯200 g/L，煮沸30 min后过滤，取清液添加蔗糖20 g/L、琼脂20 g/L，自然pH。

1.3.5 产酯培养基［5］少量水将15 g玉米粉调成糊状，然后逐渐加水至250 mL，搅拌均匀，然后在80～90℃的水浴里保持1.5 h，期间搅拌3～4次，然后过滤，将滤液补足至250 mL，加5 g琼脂，加热融化后趁热用脱脂棉过滤，121℃灭菌30 min。

1.3.6 发酵产酯培养基 将10%的鲜豆芽煮沸30 min，过滤后取清液添加葡萄糖50 g/L，自然pH。

1.4 研究方法

1.4.1 玫瑰香葡萄自然酿造过程中酵母菌的分离纯化 将玫瑰香葡萄按自然发酵进行酒精发酵，将发酵过程分为前中后3个时期并分别取样1mL，样品梯度稀释后涂布于YEPD培养基，在28℃条件下培养2～3 d，从适宜稀释度平皿中挑取全部酵母菌落，转接到WL鉴别培养基上，28℃培养5～7 d，对不同形态的酵母菌进行计数，以确定不同时期各菌株的数量，另挑取长势优良的菌株进行划线分离，进一步纯培养，获得单菌落酵母菌，保藏PDA斜面培养基，备用。

1.4.2 酵母菌的初步分类鉴定 将1.4.1中所得单菌落酵母菌划线接种在WL鉴别培养基上，28℃培养5～7 d，观察记录菌落特征，并根据其特征以及显微观察进行初步鉴定。

1.4.3 酵母菌分子鉴定 酵母菌26s rDNA扩增及序列测定由宝生物工程（大连）有限公司受托解析并完成。

1.4.4 酵母的发酵特性分析

（1）酵母的乙醇耐受性测定

将灭菌后的YPD琼脂培养基降温至50℃，按10%、12%、14%、16%、18%、20%、22%、24%、26%体积分数加入乙醇，接种新鲜酵母菌，在YPD固体平板进行生长实验［6］。28℃培养1周后，观察培养基表面是否形成醭、环或岛。用阳性（+）表示形成，阴性（-）表示不形成。如果同一水平重复试验中有极少数形成，用弱阳性（+-）表示。与此同时用葡萄酒活性干酵母作对照。

（2）葡萄汁发酵实验

将酵母菌接种到YPD培养基中，28℃条件下180 r/min震荡培养18 h，在10℃条件下10 000 r/min离心3 min，收集菌体备用。

选择玫瑰香葡萄汁进行发酵实验，调整糖度21%，500 mL三角瓶分装120 mL葡萄汁灭菌，按0.2 g/L的接种量添加酵母，在18℃条件下发酵。每24 h测定还原糖，待发酵结束即残糖量在4 g/L以下，测定发酵液的酒度、总酸、挥发酸以及香气。期间取样均在无菌操作条件下进行。

（3）酵母产酯能力测定

用平板划线法将酵母在无菌条件下接种至产酯培养基，28℃培养2～3 d，通过嗅觉初步判定是否产生酯香。

另通过发酵实验，测定发酵液总酯量:将活化好的菌种接种到发酵产酯培养基中，接种量为4%，在28℃条件下180 r/min恒温摇床中震荡培养3～4 d后取样，采用皂化中和滴定法测总酯量［7］。

（4）香气成分的检测

葡萄发酵结束后取发酵醪200 mL，经高速冷冻离心机10 000 r/min，离心15 min，取清汁贮藏在-18℃的冰柜中备用。在香气提取时从冰柜中取出葡萄酒样品，在30℃的水浴中解冻。取100 mL葡萄酒样以2 mL/min的流速通过XAD-2树脂柱，用100 mL蒸馏水洗柱，除去糖、酸及其他一些水溶性化合物。再用100 mL的戊烷:乙醚（体积比1∶1）以2 mL/min的流速洗脱吸附在柱上的游离态芳香物质，然后用分液漏斗将洗脱液有机相和水相分离。在有机相中加入烘干的无水Na2SO4，4℃放置4 h，旋转蒸发浓缩至3 mL，通过GC-MS分析［8］。

2 结果与分析

2.1 玫瑰香葡萄自然酿造过程中酵母菌的初步鉴定

WL培养基是酒类发酵过程中微生物类群鉴别培养基。葡萄酒自然发酵过程中大多数典型酵母菌都可以用WL培养基进行区分。不同种类的酵母菌在WL培养基上生长的菌落颜色和形态一般不同［9］。基于此再结合显微镜下酵母菌细胞形态的特点，可以将酵母菌进行初步聚类。在玫瑰香葡萄自然发酵过程前、中、后3个时期分别分离得到75株、139株和123株酵母菌。从中分离获得1株酵母菌记为Yeast1，其菌株的菌落形态为奶油白色，带绿色，表面光滑，不透明，边缘整齐，球型凸出。在10×100放大倍数下单细胞形态为椭圆形，如图1所示。

图1 酵母菌Yeast1在WL培养基上的菌落特征及细胞形态Fig.1 Colonies and morphological characteristics of strain Yeast1 on WL medium

根据CAVAZZA等［10］和PALLMANN等［11］描述的不同酿酒酵母在WL培养基上的特征，可初步判断酵母菌Yeast1为酿酒酵母。

2.2 酵母菌Yeast1分子鉴定结果

通过形态鉴定只能对菌株进行初步鉴定，为了得到Yeast1种属的确切信息，需要借助分子生物学的手段。将Yeast1的26s rDNA D1/D2区序列进行PCR扩增、测序，扩增结果见图2。

图2 酵母Yeast1 PCR扩增结果Fig.2 PCR results of strain Yeast1

由图2可知，Yeast1的26s rDNA D1/D2区序列长度为558 bp。将其在NCBI中进行比对，对比结果显示与S.cerevisiae的基因库接受号KM055472.1的同源性达到100%，由此可以确定Yeast1为酿酒酵母，此结果与WL培养基初步鉴定结果一致。

2.3 酵母的发酵特性

2.3.1 酵母Yeast1的乙醇耐受性 酵母菌的乙醇耐受性关系到乙醇得率，同时也是其是否有良好发酵性能的判定标准之一。在葡萄酒酿造过程中，乙醇不断积累，高浓度的乙醇会对酵母细胞产生毒害作用，导致菌体细胞无法正常生长，使生长速度减缓甚至死亡。因此，了解酵母的乙醇耐受性非常必要，并能更好地了解掌控葡萄酒发酵过程。对酵母菌Yeast1的乙醇耐受性进行了测定，结果如表1所示。

表1 酵母菌Yeast1乙醇耐受性Tab.1 Ethanol tolerance of strain Yeast1

由表1可知，酵母菌Yeast1有较高的耐受性，基本可以耐受16%的乙醇浓度，随着乙醇浓度的变化，活菌数量呈阶梯式变化。由此可见，Yeast1具有很好的乙醇耐受性，可以满足正常的发酵需要。

2.3.2 酵母Yeast1葡萄汁发酵特性 以残糖量、酒精度、挥发酸及总酸为指标，测定酵母Yeast1在葡萄汁中的发酵性能，结果如表2和图3所示。

表2 Yeast1葡萄汁发酵能力检测Tab.2 Fermentation ability of Yeastl in grape wine juice

菌株消耗还原糖能力是检测其发酵能力的必要内容之一。由图3可见，酵母Yeast1发酵初始阶段对还原糖的消耗较快，发酵第4天残糖达到60 g/L以下，从第4天开始还原糖消耗速度渐缓，发酵结束后最终残糖量为3.627 011 g/L（见表2），符合干型葡萄酒的残糖含量4 g/L以下的酿造要求。发酵完成后的酒精度为8.5%（v/v）（见表2），该酒精度与一些文献报道的酵母菌发酵产酒精度相比略低［12-14］。综合Yeast1发酵糖的速度及发酵结束后残糖含量，说明酵母Yeast1发酵力强，发酵速度快，产酒精量较高，残糖量符合酿造干型酒的要求。

图3 葡萄汁发酵过程中还原糖的变化曲线Fig.3 Curve of reducing sugar content during the fermentation

国标中对葡萄酒的挥发酸含量有明确规定，其含量应小于1.2 g/L，若挥发酸含量过高则会影响酒质。酵母Yeast1发酵完成后挥发酸含量为0.210 84 g/L（见表2），符合葡萄酒酿造中国标对这一指标的要求，且含量保持在较低的水平。

酸度对葡萄酒的风味影响较大，也可以防止酒氧化使色泽稳定，对细菌也有抑制作用。而不同酵母菌的合成代谢有明显区别，这就使得到的有机酸成分及含量各不相同，从而影响了最终发酵液的总酸含量。酵母菌Yeast1发酵完成后发酵液的总酸含量为4.160 3 g/L（见表2）。GB 15037-2006中未对总酸做严格要求，其总酸与总糖的差值在2.0 g/L及以下即可，因此对照表2的数据分析可知酵母Yeast1符合酿造要求［15］。

2.3.3 酵母产酯能力分析 为了提高葡萄酒的品质，生香酵母的选育是重要内容，酵母菌对最初酒体香气的形成有着重要意义。菌种的差异可以改变对香气形成的前体物质的作用效果，使最终酵母菌中的糖苷酶代谢产生香气的种类和含量也大有不同［16］。因此，对筛选菌种进行产酯能力的测定甚为必要。将Yeast1接种到产酯培养基中培养，通过嗅觉初步判断有明显的酯香，发酵实验及皂化中和滴定测得的总酯含量为1.264 4 g/L，由此表明Yeast1具有突出的生香效果，可以在一定程度上丰富葡萄酒香气物质种类，增加酯类成分含量，这对于酿造风格独特、高品质的具有地域特色的葡萄酒有重要意义。

2.3.4 酵母Yeast1发酵酒样中香气成分 葡萄酒最初的发酵香主要来源于酒精发酵，而参与酒精发酵最主要的则属酵母菌，酿酒酵母和非酿酒酵母均起着重要作用。酵母菌的活动与香气的形成及修饰密不可分，相关研究表明不同酵母的生理活性及代谢过程不同，因此对风味物质形成的作用效果也存在差异性［17-18］。所以，有必要了解Yeast1的发酵液香气成分，结果如图4所示。

图4 酵母菌Yeast1发酵液香气成分GC-MS总离子图Fig.4 GC-MS analysis on aroma components in Yeast1 fermentation broth

对图4所得总离子图进行分析，Yeast1发酵液中共检测出50种香气成分。在所有检测出的化合物中有醇类18种、酯类13种、醛类7种、其他酸烯酮醚等物质12种，相对百分含量分别为32.07%、5.99%、0.66%和3.74%。其中，醇类物质中相对含量较高的有异戊醇（17.21%）、苯乙醇（4.81%）、2-环-己烯醇（2.84%）、异丁醇（1.87%）、十六醇（1.82%）、芳樟醇（1.5%）。葡萄酒中的醇类物质主要来自于乙醇发酵过程，主要由氨基酸和亚麻酸转化而来。本试验检测到的苯乙醇具有玫瑰花香、蔷薇、茉莉、丁香及花粉味，是玫瑰香葡萄的特征香气。

葡萄酒中的酯类物质主要来自于葡萄浆果果皮、酒精发酵和后期储藏过程。在Yeast1发酵液总共检测到酯类物质13种，相对含量较高的有草酸二异丁酯（1.79%）、辛酸甲酯（1.03%）、己酸烯丙酯（1.00%）、乙酸乙酯（0.82%）、乙酸香叶酯（0.38%）、安息香酸乙酯（0.33%）。本次检测到相对含量最高的酯类为草酸二异丁酯和辛酸甲酯。其中，辛酸甲酯具有青苹果、果香、草莓香、茴香香味；乙酸乙酯的相对含量也较高，具有果香、青苹果、香蕉和白兰地味。这些物质对葡萄酒的香气均有积极作用。

Yeast1发酵液中醛类物质相对含量较高的有柠檬醛（0.45%）；酮类物质相对含量较高的有4-羟基-2-丁酮（0.88%）、鸢尾酮（0.98%）；酸类物质中月桂酸相对含量较高（1.05%）。

3 结论

本试验从玫瑰香葡萄自然发酵中分离到1株酵母菌记为Yeast1，分子鉴定为酿酒酵母。Yeast1酵母发酵力强，发酵速度快，产酒精量较高，残糖量符合酿造干型酒的要求。同时具有很好的乙醇耐受性和良好的产酯能力，可以满足正常的发酵需要。从Yeast1发酵液中共检测到50种香气成分，其中醇类18种、酯类13种、醛类7种、其他酸烯酮醚等物质12种。综上，昌黎产地玫瑰香葡萄自然酿造中存在较好性能的天然酵母，若将其合理利用可能会酿造出更优质、更具特色的葡萄酒，但还需大量研究工作来证实，本试验结果可以为今后的研究工作提供相关理论依据。

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（责任编辑:胡燕梅）

Isolation，Identification and Fermentation Analysis of a Wild Saccharomyces Cerevisiae

YAN Hejing，SHI Yue，LIU Chang，LI Runfeng
（College of Food Science and Technology，Hebei Normal University of Science and Technology，Changli 066600，Hebei，China）

In this experiment，one Saccharomyces cerevisiae was screened and identified from Muscat wine natural brewing broth with morphological method and molecular technology，which was named as Yeast1.Firstly，Yeast1 could tolerate 16%（v/v）ethanol.Moreover，after the fermentation of grape juice by Yeast1，the content of residual sugar，of ethanol，of volatile acid，of total ester and of total acid were 3.627 011g/L、8.5%、0.210 84g/L、1.264 4g/L and 4.160 3g/L，respectively.These results indicated that Yeast1 has better fermentation ability，and can initiate the fermentation immediately and produce a higher content of ethanol.At the same time，the residual sugar in Yeast1 fermentation broth fit the standard for dry wine production.Furthermore，there are 50 kinds of aroma compounds were detected by GC-MS in Yeast1 fermentation broth，of which，there are 18 kinds of alcohol compounds，13 kinds of ester compounds，7 kinds of aldehyde compounds and other 12 kinds of compounds like acids，ketene and ether，and so on.These results indicated that there are yeasts with good fermentation properties in muscat wine natural process in Changli district，which maybe produce better wines in quality and characteristic if they were used appropriately.

muscat grapes wine；natural yeast；isolation；identification；fermentation analysis

Q93.3；TS261.11；TS262.61

A

1673-0143（2015）05-0454-06

10.16389/j.cnki.cn42-1737/n.2015.05.015

2015-06-23

河北省高等学校科学技术研究项目（QN2014143）；河北科技师范学院博士研究启动基金资助项目

阎贺静（1978—），女，副教授，博士，研究方向：发酵工程。