多功能芽孢杆菌AF1的生长条件与生理耐受特性研究

杨艳红，李世川，胡 燕，刘余江

(重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054)

芽孢杆菌多数为腐生菌，具有产生抗性芽孢、繁殖能力强、耐热、耐酸碱、理化性质稳定、抑菌谱广泛等优点，存在很多潜在的特殊功能，特别是可产生多种胞外抗菌物质和包括淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等在内的多种酶类，因此在工农业生产以及科学研究中有广泛的应用价值［1－3］。芽孢杆菌类微生物添加剂无毒、无害、无残留，且具有促进畜禽生长、防治疾病等功效，是国际公认的可在饲料中直接使用的微生物菌种［4］。重庆理工大学生物工程实验室分离到一株能产生高淀粉酶和蛋白酶活性、且具有广谱抗菌活性的芽孢杆菌。本文就其生理耐受性特性和发酵条件进行研究，以期为该菌种应用于饲料微生物添加剂提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种AF1，由重庆理工大学生物工程实验室分离。培养基为PDA培养基。

1.2 生长培养基的筛选

1.2.1 碳氮源筛选

在PDA培养基的基础上，采用单因素实验分别筛选AF1生长的最佳碳源和氮源分别为:4%蔗糖，2%蛋白胨、0.5%尿素。根据单因素实验结果，进一步设计正交实验，对蔗糖、蛋白胨和尿素浓度进行优化，以测定OD600代表菌体浓度。各因素水平设定值见表1。

表1 碳氮源正交设计因素水平

1.2.2 无机盐筛选

微生物生长所需的无机盐一般有磷酸盐、硫酸盐、氯化物以及含有钠、钾、钙、镁、铁等金属元素的化合物。在细菌培养时通常添加以下无机盐:MgSO4.7H2O、K2HPO4、NaCl、MnSO4、H2O、CaCl2、NaH2PO4。本实验室选取以上6种无机盐，在碳氮源筛选的基础上，通过均匀设计实验来进一步优化发酵培养基，以测定OD600代表菌体浓度。各因素设6个水平，其设定值见表2。

表2 无机盐均匀设计因素水平

1.3 理化因素的筛选

先经单因素预实验分别设定:温度为10，25，35 ℃;pH 值为 2.0，5.0，7.0;摇床转速为 150，250，280 r/min。对这3个水平进行初筛，结果显示获得较大OD600的条件分别是:pH值为7.0，温度为35℃，转速250 r/min。然后在确定的3个因素值附近分别设定3个水平进行正交实验。正交实验因素水平见表3。

表3 理化因素正交设计因素水平

1.4 生理耐受性实验

1.4.1 pH 耐受性

以上述筛选的最优培养基为基础，分别调节不同的pH值，每个pH值做3个平行实验，在筛选的最佳条件下培养20 h后测定OD600值。

1.4.2 猪胆盐耐受性

以上述筛选的最优培养基为基础，分别添加猪胆盐 0%，0.04%，0.08%，0.1%，0.2%，0.3%，每个浓度做3个平行实验，在筛选的最佳条件下培养20 h后测定OD600值。

1.4.3 人工胃液耐受性

将AF1接种于以上筛选的最优培养基中进行活化，并参照文献［5－6］把AF1菌接种于人工胃液，在最佳条件下进行摇床培养，分别于0，30，60和120 min取样，采用活菌平板计数法测定活菌数量。

1.4.4 人工肠液耐受性

将AF1接种于以上筛选的最优培养基中进行活化，并参照文献［5－6］把AF1菌接种于人工肠液，在最佳条件下进行摇床培养，分别于0，30，60和180 min取样，采用活菌平板计数法测定活菌数量。

2 结果与讨论

2.1 生长培养基筛选

2.1.1 碳氮源筛选

由表4中极差值R可以得出各因素对AF1菌生长的影响由大到小依次为:尿素＞蛋白胨＞蔗糖。同时，也可以知道AF1菌液体培养的最佳碳源和氮源组合为A3B1C1，即蛋白胨2.5%，尿素0.5%，蔗糖3.0%。为了验证本次实验中所确定的培养条件(碳源和氮源)是否可靠，选用原正交实验中OD600值最大的实验号(A3B1C3)与所筛选出的最佳条件作对比验证实验，结果如表5所示。可见原实验中OD值最大的实验组合的OD值小于我们所筛选出最佳条件的OD值。因此，A3B1C1仍然是最佳的组合，同上述分析结果吻合。因此，最后确定AF1生长培养基中最佳碳源和氮源的组合为:3.0%蔗糖，0.5%尿素，2.5%蛋白胨。

表4 碳源和氮源正交实验结果

表5 验证实验结果

2.1.2 无机盐筛选

对表6实验结果用SPSS软件进行回归分析，可得出回归方程为:y=6.62 －13.54x1+0.66x3。这是一个二元线性回归方程，为检验其可信性，对回归方程进行方差分析，其方差分析表［7］如表7所示。由方差分析结果可知该线性方程是比较可靠的，回归方程中x1的系数为负，x3的系数为正，表明菌体OD600值随因素x1(MgSO4·7H2O)的增加而下降，随着因素x3(NaCl)的增加而上升。因此，在确定无机盐的最优方案时，将MgSO4·7H2O的量取下限，即为0%，NaCl的量取上限，即为1.0%。为了验证筛选结果的准确性，选取原实验设计中OD600值最大的实验条件(即表6中2号实验)和筛选出的实验条件作对比验证。结果显示，原设计中2号实验的OD600值为7.64，小于所筛选出最佳条件的OD600值9.96，可见实验结果可靠。无机盐是微生物生长必不可少的一类营养物质，在细菌机体中的生理功能主要是作为酶活性中心的组成部分、维持生物大分子和细胞结构的稳定性、调节并维持细胞的渗透压平衡、控制细胞的氧化还原电位和作为某些微生物生长的能源物质等。微生物生长所需的无机盐一般有磷酸盐、硫酸盐、氯化物以及含有钠、钾、钙、镁、铁等金属元素的化合物。在微生物的生长过程中还需要一些微量元素。微量元素是指那些在微生物生长过程中起重要作用，而微生物机体对这些元素的需要量极其微小的元素，通常需要量在 10－6～10－8mol/L(培养基中含量)。微量元素一般参与酶的组成或使酶活化［8］。由上述结果可见，本实验中，K2HPO4、MnSO4.H2O、CaCl2、NaH2PO4对AF1菌的生长几乎无影响，而MgSO4·7H2O对其生长有负影响，NaCl有正影响。最终只选定NaCl这一无机盐补充到培养基中。这可能是由于本实验中的培养基中添加了天然土豆汁，其中含有丰富的微量元素可完全满足AF1菌生长。综合碳氮源筛选结果，AF1菌的生长培养基优化为:马铃薯20 g，蔗糖 3 g，蛋白胨 2.5 g，尿素 0.5 g，NaCl 1.0 g，蒸馏水100 mL。本培养基中由于马铃薯的质量不好控制，因此本实验室参照土豆的主要有效成分，以这些成分为筛选对象，对培养基进行进一步优化。

表6 无机盐均匀实验结果

表7 方差分析表

2.2 理化因素筛选

由极差值R可以得出各因素对AF1菌生长的影响由大到小依次为:温度＞转速＞初始pH值。同时，也可以知道AF1液体培养的最佳理化条件组合为A3B3C2，即温度为37℃，初始pH值为7.0，摇床转速为200 r/min。

2.3 生理耐受性实验

2.3.1 pH 耐受性

动物胃中的pH值范围常在2～7，一般为3.0。胃环境对细菌的破坏是pH依赖性的酸水解作用，当pH值为2.5时，杀菌作用很明显。因此，益生菌必须有良好的耐酸能力，才能通过高酸性的胃环境而到达肠道发挥作用［9］。由图1可知，AF1在pH值为2～9时均可以生长，而在pH值为4～8时生长较好，其最佳生长pH值为7。因此，该菌有很好的耐酸性，可以耐受动物胃的低pH环境，并顺利进入pH值约为7.6的小肠发挥作用。

表8 理化因素正交实验结果

图1 AF1的pH耐受性

2.3.2 胆盐耐受性

益生菌进入肠道后，小肠中胆盐的高渗透压环境不利于其存活。动物肠道中胆盐的含量为0.03% ～0.3%(W/V)，并不断发生变化，一般认为其平均含量为0.03%［10］。如图2所示，AF1菌株在胆盐浓度为0.04% ～0.3%均有一定耐受能力。随着胆盐浓度的升高，AF1的存活数呈现缓慢的下降趋势。因此，AF1菌株能耐受肠道的胆盐环境。

2.3.3 人工胃液耐受性

动物的胃在pH值为3.0左右的酸性环境下激活胃液中的胃蛋白酶原，从而杀死胃内的细菌，食物通过胃的时间相对较短，一般为1～2 h［11］。由表9可知，AF1在加了胃蛋白酶的人工胃液中2 h后还能存活，因此，AF1对胃液有耐受能力。

表9 在不同培养时间下AF1在模拟胃液中的存活率

2.3.4 人工肠液耐受性

小肠内消化是整个消化过程中重要的阶段，也是各种益生菌制剂发挥作用的场所。小肠液的pH值约为7.6，其中除了大量的水分外，还有各种酶、胆汁盐等多种成分，对肠内菌群有着多方面的影响。食物通过动物小肠的平均时间约为1.5 h。益生菌只有经受住小肠液作用，保持一定数量的存活率才能发挥作用［5，11］。由表10可知，人工肠液对AF1菌株几乎没有影响，这说明AF1菌株能够耐受肠液环境，可以在肠液中生长。

表10 在不同培养时间下AF1在模拟人工肠液中的存活率

3 结束语

本文研究的芽孢杆菌AF1不仅可以产生高活性淀粉酶和蛋白酶，还具有广谱抗菌活性，若用于动物，不仅可以提高饲料利用率，促进生长，同时可以预防动物疾病发生。通过对AF1研究，发现其具有肠道环境耐受性好的优点，可为新型饲料微生态制剂的开发提供菌种来源。

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