高效液相色谱内标法测定酱油中糖精钠和苯甲酸钠

邸万山（辽宁石化职业技术学院应用化学系，辽宁锦州121001）

高效液相色谱内标法测定酱油中糖精钠和苯甲酸钠

邸万山
（辽宁石化职业技术学院应用化学系，辽宁锦州121001）

以山梨酸钾为内标物，采用高效液相色谱法测定酱淮中的糖精钠和苯甲酸钠的含量。样品经体积分数为50%的乙醇溶液提取后，采用Nova-Pak C18色谱柱（3.9 mm×15 mm×5 μm）分离，以甲醇-0.02 mol/L乙酸铵（5∶95，V/V）为流动相进行洗脱，流速1 mL/min，紫外检测波长230 nm。结果表明，在0.1～1.4 mg/kg的添加范围，糖精钠、苯甲酸钠的加标回收率分别为99.5%～102.3%，95.1%～102.1%，相对标准偏差（RSD）分别为0.69%和0.82%。所测酱淮中糖精钠和苯甲酸钠的含量分别为3.27 mg/kg和0.133 mg/kg。采用该方法回收率高、准确性好，可用于酱淮中糖精钠和苯甲酸钠含量分析。

高效液相色谱法；酱淮；糖精钠；苯甲酸钠；检测

随着生活水平的提高，食品的种类也日益丰富，为了提高食品的保藏性能，延长保质期，改善食品的感官性状，在食品中加入适量的防腐剂、甜味剂、发色剂、人工合成色素等添加剂来改变食品的色、香、味、形等特征。但是，食品添加剂加入量若超过了国家标准允许的最大使用量，就会对人体产生危害［1］。我国对糖精钠、苯甲酸钠的最大使用量的规定分别为5 mg/kg和0.15 g/kg［2］。

酱淮俗称豉淮，是我国传统的酿造食品，富含多肽、氨基酸等营养成分，对人体铁吸收有促进作用［3］。主要以大豆、小麦、麸皮、食盐等为原料，在米曲霉分泌酶系的协同作用下，经过制曲、发酵等程序酿制而成的液体调味品。酱淮除食盐成分外，还包括多种氨基酸、可溶性蛋白质、还原糖类、有机酸、色素及香料等成分［4-5］。它能改善菜肴的味道，增添菜肴的色泽；除此之外，酱淮中还含有钙、铁等营养元素，能有效维持机体的生理平衡。因此，酱淮不但具有良好的风味和滋味，而且营养丰富，是人们烹饪的重要传统调味品［6］。目前，对酱淮的研究主要集中在酱淮酿造工艺的改进［7］、有效成分分析［8-9］等方面，而有关用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）内标法测定酱淮中糖精钠、苯甲酸钠含量分析的报道较少。

目前国内外对糖精钠、苯甲酸钠含量检测的方法主要有紫外分光光度法、液相色谱外标法等方法。其中高效液相色谱内标法具有检出限低、动态线性范围宽、精密度高、准确度高、基体效应小、分析速度快、可同时测定多种共存组分等优点，已广泛应用于食品成分分析［10-12］。本研究目的在于建立内标法测定酱淮中的糖精钠、苯甲酸钠。样品经乙醇溶液提取后，采用Nova-Pak C18（3.9 mm×15 mm× 5 μm）色谱柱分离，以甲醇-乙酸铵为流动相进行洗脱，紫外检测波长230 nm。本实验以山梨酸钾为内标物对酱淮中的糖精钠、苯甲酸钠进行了测定，为酱淮的质量评价提供参考依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

酱淮样品：市售；甲醇、乙酸铵均为色谱纯（纯度≥99.7%）：国药集团化学试剂有限公司；糖精钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、乙醇、盐酸均为分析纯：天津市化学试剂三厂。

1.2仪器与设备

810型高效液相色谱仪：美国Waters公司；KQ-700DB数控超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司；Milli-Q超纯水系统：美国Millipore公司；AUW120D电子分析天平：日本岛津公司。

1.3试验方法

1.3.1色谱条件

色谱柱：Nova-PakC18（3.9mm×15mm×5 μm）；流动相：甲醇/0.02 mol/L乙酸铵（5∶95，V/V）；流速：1 mL/min；检测波长：λ=230 nm；灵敏度：0.2 AUFS；柱温：25℃；进样体积：10 μL。

1.3.2溶液的制备

0.02 mol/L乙酸铵溶液的配制：称取1.54 g乙酸铵，加1 000 mL水溶解。

1.000 0 mg/mL山梨酸钾标准溶液的配制：准确称取0.100 0 g山梨酸钾，加入适量水溶解，置于100 mL容量瓶中，加水定容、摇匀。

1.000 0 mg/mL糖精钠标准溶液的配制：准确称取0.1000g烘干4h后的糖精钠，加入适量水溶解，置于100mL容量瓶中，加水定容、摇匀。

1.000 0 mg/mL苯甲酸钠标准溶液的配制：准确称取0.100 0 g苯甲酸钠，加1 mL 20 g/L碳酸氢钠溶液，加入适量水溶解，置于100 mL容量瓶中，加水定容、摇匀。

1.000 0 mg/mL糖精钠-苯甲酸钠-山梨酸钾混合标准贮备溶液的配制：准确称取糖精钠、苯甲酸钠、山梨酸钾各0.100 0 g，加入适量水溶解，置于100 mL容量瓶中，加水定容、摇匀。

0.1000 0 mg/mL糖精钠-苯甲酸钠-山梨酸钾混合标准使用溶液的配制：准确移取糖精钠-苯甲酸钠-山梨酸钾混合标准贮备溶液10.00 mL，置于100 mL容量瓶中，加水定容、摇匀。

1.3.3试样的预处理

称取酱淮样品10.232 5 g于100 mL容量瓶中，加入0.5 mL盐酸（1∶1）酸化后，加入25 mL体积分数为50%的乙醇溶液，超声提取25 min，然后加入0.001 0 mg山梨酸钾，用体积分数为50%的乙醇溶液定容至刻度，摇匀。用0.45 μm滤膜过滤，作为供试液。

1.3.4定性分析

分别取糖精钠、苯甲酸钠、山梨酸钾标准溶液及试样处理液10 μL在相同的色谱条件下分别注入高效液相色谱仪进行检测，根据标准溶液色谱峰的保留时间为依据对供试液中的成分进行定性分析。

1.3.5糖精钠、苯甲酸钠对内标物山梨酸钾的相对响应值

取糖精钠-苯甲酸钠-山梨酸钾混合标准使用溶液10 μL注入高效液相色谱仪进行分析，得到糖精钠、苯甲酸钠、山梨酸钾的峰面积，分别计算其与山梨酸钾相应对响应值。

苯甲酸钠与山梨酸钾的相对响应值计算公式如下：

式中：Sa1表示苯甲酸钠与山梨酸钾的相对响应值；Aa1、As分别为混合标准使用溶液中苯甲酸钠、山梨酸钾的峰面积；Wa1、Ws分别为混合标准使用溶液中苯甲酸钠、山梨酸钾的质量，g。

糖精钠与山梨酸钾的相对响应值计算公式如下：式中：Sa2表示糖精钠与山梨酸钾的相对响应值；Aa2、As分别为混合标准使用溶液中苯甲酸、山梨酸钾的峰面积；Wa2、Ws分别为混合标准使用溶液中苯甲酸、山梨酸的质量，g。

1.3.6定量分析

取试样处理液10 μL，注入高效液相色谱仪进行分析，得到糖精钠、苯甲酸钠、山梨酸钾的峰面积，根据相对响应值计算试样中糖精钠和苯甲酸钠的质量。试样中苯甲酸钠、糖精钠含量的计算公式如下：

式中：W样苯表示试样中苯甲酸钠的质量，g；W样山表示试样中山梨酸钾的质量，g；W样糖表示试样中糖精钠的质量，g；W样表示试样的质量；A样苯表示试样中苯甲酸钠的峰面积；A样山表示试样中山梨酸钾的峰面积；A样糖表示试样中糖精钠的峰面积。

2　结果与分析

2.1检测波长的确定

根据参考文献［13］，糖精钠、苯甲酸钠、山梨酸钾分别在波长204 nm、224 nm、254 nm处有较大紫外吸收，在此基础上，在波长200～400 nm进行紫外光谱扫描，结果如图1所示。

由图1可知，糖精钠、苯甲酸钠、山梨酸钾最大吸收波长分别为228 nm、230 nm、233 nm，3种物质在波长230 nm处都有明显吸收。因此，选择230 nm作为检测波长。

图1　糖精钠、苯甲酸钠、山梨酸钾紫外吸收光谱Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of saccharin sodium，sodium benzoate and potassium sorbate

2.2内标物的选择

选择山梨酸钾作为内标物符合以下3点的要求：一是酱淮试样中不应含有内标物山梨酸钾；二是山梨酸钾的保留值应该介于与糖精钠、苯甲酸钠之间，又能满足分离度＞1.5；三是山梨酸钾的加入量与糖精钠、苯甲酸钠的峰面积匹配性＞75%［14］。山梨酸钾的保留时间介于苯甲酸钠和糖精钠之间，并且3者能够完全分离，满足作内标物的要求。

2.3标准品及样品HPLC色谱图

采用高效液相色谱法对混合标准溶液及待测样品按照色谱工作条件的要求进行检测，所得到的色谱图见图2所示。

图2　混合标准溶液（A）和待测样品（B）色谱图Fig.2 Chromatogram of mixed standard solution（A）and sample（B）

由图2可知，待测样品（B）色谱图中出现苯甲酸钠、糖精钠2个色谱峰，说明样品中不含有山梨酸钾。而混合标准溶液（A）色谱图中出现苯甲酸钠、山梨酸钾、糖精钠3个色谱峰，并且分离效果良好。因此，山梨酸钾可以作为测定苯甲酸钠、糖精钠的内标物。

2.4精密度的测定

取糖精钠、苯甲酸钠标样，平行进样5次，检测到糖精钠标样的相对响应值分别为1.105、1.092、1.098、1.095、1.097，平均值为1.097；苯甲酸钠标样的相对响应值分别为1.216、1.209、1.212、1.210、1.199，平均值为1.209。计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），RSD值分别为0.69%和0.82%。结果显示该方法的精密度高，能满足酱淮中糖精钠和苯甲酸钠的分析要求。

2.5方法的回收率试验

在已知含量的试样中分别加入不同质量浓度的的糖精钠、苯甲酸钠标准溶液进行回收率试验，结果见表1。

表1　酱淮中糖精钠和苯甲酸钠加标回收率Table 1 Recovery rates of saccharin sodium and sodium benzoate in soy sauce

由表1可知，糖精钠、苯甲酸钠的加标回收率结果分别为99.5%～102.3%，95.1%～102.1%。结果表明，该方法的准确度较好。

2.6样品的检测

表2　酱淮中糖精钠和苯甲酸钠的含量Table 2 Contents of saccharin sodium and sodium benzoate in soy sauce

对酱淮供试液进行检测，计算其糖精钠和苯甲酸钠的含量，结果见表2。由表2可知，待测酱淮中糖精钠和苯甲酸钠的含量分别为3.27 mg/g和0.133 mg/kg。

3　结论

以山梨酸钾为内标物，建立了一种高效液相色谱内标法测定酱淮中糖精钠和苯甲酸钠的方法。该方法与外标法［15-16］比较避免了由于进样体积、检测器灵敏度、流速以及流动相组成发生变化对测定结果的影响。具有回收率高、准确度高，并且前处理简单，操作时间短等优点，适用于酱淮等常见调味品中糖精钠、苯甲酸钠含量的测定。也同样适用于其他含有糖精钠和苯甲酸钠样品的测定，应用前景广泛。

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Determination of saccharin sodium and sodium benzoate in soy sauce by HPLC internal standard method

DI Wanshan
（Department of Applied Chemistry，Liaoning Petrochemical Vocational and Technical College，Jinzhou 121001，China）

With potassium sorbate as internal standard，the content of saccharin sodium and sodium benzoate in soy sauce was determined by HPLC. Samples were extracted by 50%ethanol solution，separated by Nova-Pak C18column（3.9 mm×15 mm×5 μm），eluted by methanol-0.02 mol/L ammonium acetate（5∶95，v/v）as mobile phase，with flow rate of 1 ml/min，UV detection wavelength of 230 nm.Results showed that with the added level of 0.1-1.4 mg/kg，standard addition recoveries of saccharin sodium，sodium benzoate were 99.5%-102.3%and 95.1%-102.1%，respectively.The relative standard deviation was 0.69%and 0.82%，respectively.The content of saccharin sodium and sodium benzoate in soy sauce were 3.27 mg/kg and 0.133 mg/kg，respectively.The method was with high recovery rate and good accuracy，and it can be used for saccharin sodium and sodium benzoate content analysis in soy sauce.

HPLC；soy sauce；saccharin sodium；sodium benzoate；detection

TS207.3

A

0254-5071（2015）11-0153-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.035

2015-10-14

邸万山（1966-），男，副教授，本科，主要从事工业分析、食品分析、环境分析工作。