氮磷锌配施对水稻幼苗生长及抗氧化酶活性影响的研究

彭文勇等

摘要：2010年4～6月于华中农业大学盆栽场以水稻品种Ⅱ-623为材料，进行了氮、磷、锌配施盆栽试验，研究氮、磷、锌配施对水稻（Oryza sativa L.）幼苗生长及抗氧化酶活性的影响。结果表明，氮营养对水稻株高、叶绿素a含量、SOD、POD、CAT、APX活性起主要效应，而磷对根系生长影响大于氮和锌。与单一施用氮肥相比，氮磷、氮锌配合施用增加了水稻叶绿素a含量和水稻株高，促进了根系活力。平衡施用氮、磷、锌肥，水稻根长、根系活力、株高、叶绿素a含量均处于较高水平，较CK均有所增加，叶片SOD、POD、CAT、APX活性则最低，较CK均有所降低。综上所述，平衡施用氮、磷、锌肥可有效缓解水稻幼苗来自养分等环境胁迫，促进水稻根系和地上部生长。

关键词：氮；磷；锌；水稻（Oryza sativa L.）；抗氧化酶

中图分类号：S511 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）18-4419-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.010

锌是作物生长发育必需的微量元素，参与200多种酶的调节、稳定和催化作用，供锌对作物的生长发育具有重要意义[l-5]。水稻（Oryza sativa L.）是我国重要的粮食作物，移栽水稻在插秧后2～4周内易发缺锌症，导致僵苗不发，严重影响水稻高产潜力的发挥[6]，因此苗期供锌异常重要。氮、磷是水稻正常生长发育必需的营养元素，是水稻产量的主要影响因子，因此现代农业生产中普遍利用氮磷肥提高水稻产量。但目前关于长江中下游油-稻轮作区氮、磷、锌配合施用对水稻生长发育的影响鲜见报道，研究氮、磷、锌配合施用对水稻生长发育影响研究具有重要意义。鉴于此，本研究从天门市多年以油-稻轮作制为主要种植方式的田块，在油菜成熟以后，取回土壤，通过盆栽试验模拟油-稻轮作环境，研究了氮、磷、锌配合施用对水稻幼苗生长发育及抗氧化酶活性的影响，旨在为油-稻轮作下的水稻生产合理施用锌肥，提高水稻幼苗素质而提供理论基础和科学指导。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验于2010年4～6月在华中农业大学资源与环境学院盆栽场进行。供试土壤为水稻土，基本理化性质为：pH 7.85，有机质18.41 g/kg，碱解氮53.55 mg/kg，速效磷11.77 mg/kg，速效钾106.35 mg/kg，有效锌2.19 mg/kg。供试水稻品种为Ⅱ-623（四川种业公司生产）。供试肥料中氮肥为尿素，磷肥为磷酸二氢钠，钾肥为氯化钾，锌肥为七水硫酸锌，各肥料均为分析纯试剂。

土样从油菜田取回后，风干、捡出杂物、过筛，装入聚乙烯塑料盆，每盆装土9 kg，然后用水浸泡2 d，肥料用水溶解后与浸泡2 d的土样搅拌均匀后放置2 d。水稻种用NaClO4消毒后在自来水中浸泡24 h（每8 h换1次水），然后用纱布包裹转移到电热恒温培养箱中，25 ℃培养，待水稻种露白后栽入盆中。

采用三因素两水平的完全均衡设计，氮为N0（0 mg/kg）和N（240 mg/kg），磷为P0（P2O5 0 mg/kg）和P（P2O5 250 mg/kg），锌为Zn0（ZnSO4·7H2O 0 mg/kg）和Zn（ZnSO4·7H2O 7.12 mg/kg）。三因素两水平完全均衡组合，CK（N0P0Zn0）、 Zn（N0P0Zn）、 P（N0PZn0）、PZn（N0PZn）、N（NP0Zn0）、NZn（NP0Zn）、NP（NPZn0）和NPZn共8个处理组合，每个处理3次重复，为了排除非试验因素钾干扰，本试验统一施用K2O 200 mg/kg。水稻幼苗培养25 d，在9：00～11：00采取叶片，测定根系活力、叶绿素含量、SOD、POD、CAT及APX活性。

1.2 测定指标

1.2.1 根系活力测定 参照文献[7]采用TTC染色法测定水稻根系活力。

根系活力=GTF还原量（μg）/[根重（g）×时间（h）]

1.2.2 叶绿素a含量测定 参照文献[8]采用酒精浸提分光光度法测定叶片叶绿素a含量，称取叶片约0.10 g，放入研钵中，加入适量95%乙醇研磨直到组织变白，过滤到25 mL容量瓶中，用95%乙醇洗涤研钵2～3次，全部过滤，再用95%乙醇沿滤纸周围洗脱色素，最后定容至25 mL，以95%乙醇为参比，分别测定665 nm和649 nm波长下吸收峰，获得叶绿素含量。计算公式为：Chl.a（mg/g）=（13.95×OD665 nm-6.88×OD649 nm）×25×1 000/m（m为称取叶片重，g）。

1.2.3 抗氧化酶活性测定 参照文献[9]测定超氧化物歧化酶（SOD）活性，反应液为3 mL，含有磷酸缓冲液（50 mmol/L，pH 7.8）1.75 mL，10 mmol/L Na2-EDTA 0.3 mL，130 m Met（甲硫氨酸）0.3 mL，0.63 mmol/L NBT（氮蓝四唑）0.3 mL，13 U mrib（核黄素）0.3 mL，加入50 μL的酶提取液后，在装有荧光灯管的培养室内（温度25 ℃）内光照20 min，以放置黑暗处的试管作为对照管，SOD活性定义为每微克蛋白质在每小时内抑制NBT光化还原50%量为一个酶活性单位。

过氧化物酶（POD）活性测定参照Rao等[10]的方法：反应液为3 mL，磷酸缓冲液（100 mmol/L，pH 6.5）2.085 mL，50 mmol/L愈创木酚0.9 mL，10%（V/V）H2O2 10 μl，加入5 μL的酶提取液后在470 nm处测定5 min内吸光度变化值，反应由愈创木酚启动，酶活性用愈创木酚的吸光系数26.6 mmol/L·cm计算，POD活性定义为每毫克蛋白质在每分钟内降解1 μmol愈创木酚量为一个酶活性单位。

过氧化氢酶（CAT）活性测定参照Rao等[11]的方法，反应液为3 mL，含有磷酸缓冲液（100 mmol/L，pH 7.0）2.9 mL ，30%（V/V）H2O2 6.8 μL，加0.1 mL酶提取液后在240 nm处测定5 min内吸光度的变化值，反应由H2O2启动，酶活性用H2O2的吸光系数26.6 mmol/L·cm计算，CAT活性定义为每毫克蛋白质在每分钟内降解1 μmol H2O2量为一个酶活性单位。

抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定参照Rao等[11]的方法，反应液为3 mL，含有磷酸缓冲液（100 mmol/L，pH 7.5）2.6 mL，0.3%（V/V）H2O2 6.8 μl，50 μmol/L抗坏血酸（ASA）0.3 mL，加0.1 mL酶提取液后在290 nm处测定3 min内吸光度变化值，反应由ASA启动，酶活性用ASA的吸光系数2.8 mmol/L·cm计算，CAT活性定义为每毫克蛋白质在每分钟内降解1 μmol ASA量为一个酶活性单位。

蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝G-250法[12]，以牛血清白蛋白为标准。

1.3 作图

采用Excel 2000 软件作图。

2 结果与分析

2.1 氮、磷、锌及其配施对水稻幼苗生长的影响

由图1可知，水稻植株经25 d氮、磷、锌及其配施处理后，各处理水稻株高表现为NPZn>NP>NZn>N>P>Zn>PZn>CK，根长表现为NPZn>P>PZn>Zn>CK>NP>N>NZn。由此可见，氮、磷、锌3个试验因子中，氮营养对水稻植株地上部生长起主要效应，其次是磷，再次是锌；磷营养对根系生长的影响大于氮和锌，在氮营养存在基础上，增加磷和锌能促进水稻植株地上部和地下部的生长。NPZn、NP、NZn处理株高较CK分别增加66.12%、40.69%和24.59%；而磷锌配合施用与单独施用磷、锌相比，降低了水稻株高。各处理均以NPZn配合处理水稻株高及根系长度最大，说明平衡氮、磷、锌配合供给更能够促进水稻根部和地上部生长。

2.2 氮、磷、锌及其配施对水稻根系活力的影响

根系活力是植物生长状况指标，根系活力越高，表明植物地下部的活动越旺盛，其吸收养分的能力越强。由图2可见，水稻植株经25 d氮、磷、锌及其配施处理后，各处理水稻根系活力表现为NPZn>NP>Zn>P>PZn>CK>NZn>N，说明磷、锌及其配合施用均不同程度的增加了水稻根系活力，与对照相比，分别增加8.31%、14.35%和3.59%。而氮肥及氮锌配合施用却降低了水稻幼苗根系活力，与CK处理相比，分别降低19.14%、13.16%。在施用氮肥基础上，增加磷肥（NP）及磷锌肥（NPZn）能较大幅度提高水稻幼苗根系活力，与对照相比分别增加17.94%和40.67%。所有处理以NPZn配施处理水稻根系活力最大，表明平衡供给氮、磷、锌肥，能增加水稻根系活力，促进其生长。

2.3 氮、磷、锌及其配施对水稻幼苗叶绿素a含量的影响

由图3可见，水稻植株经25 d氮、磷、锌配施处理后，氮、磷、锌及配合施用对水稻叶绿素a含量具有显著影响，N、NP、NZn和NPZn 4个含氮处理及Zn处理，水稻幼苗叶绿素a含量显著高于CK、P和PZn处理；P和PZn处理叶绿素a含量较CK处理分别增加20.20%和16.67%。4个含氮处理及锌处理之间，叶绿素a含量变化趋势为NZn>NP>Zn>NPZn>N。由此可见，氮营养对水稻幼苗叶绿素a含量起主要效应，其次是锌，再次是磷，在施用氮肥的基础上，配合供给磷、锌营养，可以有效增加水稻幼苗叶绿素a含量，促进水稻幼苗光合作用，有利于水稻幼苗的生长。

2.4 氮、磷、锌及其配施对水稻幼苗叶片超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响

由图4可见，水稻植株经过25 d氮、磷、锌配施处理后，氮、磷、锌及其配合施用水稻叶片SOD活性显著低于不施肥处理，4个含氮处理N、NP、NZn和NPZn叶片SOD活性显著低于4个无氮处理，4个含氮处理之间叶片SOD活性无显著差异，其活性大小表现为：NP>NZn>N>NPZn。4个无氮处理叶片SOD活性具有明显差异，表现为CK>Zn>PZn>P。在所有处理中，以NPZn处理水稻幼苗叶片SOD活性最低，较对照降低了46.78%。可见，氮对水稻叶片SOD活性起主要作用，其次是磷，再次是锌，平衡施用氮、磷、锌肥可以有效降低水稻苗期来自养分等的环境胁迫，其水稻幼苗叶片SOD活性最低，有利于幼苗正常生长。

2.5 氮、磷、锌及其配施对水稻幼苗叶片过氧化物酶（POD）活性的影响

由图5可见，水稻植株经25 d氮、磷、锌及其配施处理后，各处理POD活性大小为CK>Zn>PZn>P>NZn>NP>N>NPZn，氮、磷、锌及其配合处理水稻叶片POD活性显著低于CK。4个氮处理叶片POD活性低于4个无氮处理，4个含氮处理中N、NP、NZn处理叶片POD活性无显著差异，4个无氮处理叶片POD活性差异显著，P、Zn、PZn处理POD活性较CK分别降低57.47%、42.16%、54.80%。在所有处理中，以NPZn处理水稻幼苗叶片POD活性最低，较CK降低了80.82%。可见，氮对水稻叶片POD活性起主要作用，其次是磷，再次是锌，平衡供给氮、磷、锌肥可有效降低水稻苗期养分等胁迫，有利于幼苗生长。

2.6 氮、磷、锌及其配施对水稻幼苗叶片过氧化氢酶（CAT）活性的影响

由图6可见，水稻植株经25 d氮、磷、锌配施处理后，氮、磷、锌及其配合施用水稻叶片CAT活性显著低于CK，4个含氮处理叶片CAT活性低于4个无氮处理，4个含氮处理叶片CAT活性大小为NP>NZn>N>NPZn，但无明显差异。4个无氮处理叶片CAT活性大小为CK>PZn>P>Zn，P、Zn和PZn处理较CK分别降低40.56%、46.05%和40.37%。在所有处理中，以NPZn处理水稻幼苗叶片CAT活性最低，较CK降低62.31%。可见，氮对水稻叶片CAT活性起主要作用，其次是锌，再次是磷，平衡施用氮、磷、锌肥可以有效降低水稻苗期养分等环境胁迫，有利于幼苗生长。

2.7 氮、磷、锌及其配施对水稻幼苗叶片抗坏血酸酶（APX）活性的影响

由图7可见，水稻植株经25 d氮、磷、锌配施处理后，各处理水稻APX活性大小顺序为CK>Zn>P>PZn>NZn>NP>N>NPZn，氮、磷、锌及其配合施用水稻叶片APX活性显著低于不施肥处理，4个含氮处理叶片APX活性低于4个无氮处理，虽然NZn、NP处理叶片APX活性略高于N处理，但三者APX活性无显著差异，较CK分别降低50.58%、52.18%和55.00%。与CK相比，P、Zn、PZn处理叶片APX活性分别降低44.43%、42.44%、47.78%，三者亦无显著差异。在所有处理中，以NPZn处理水稻幼苗叶片APX活性最低，较CK降低了66.91%。综上所述，氮对水稻叶片APX活性起主要作用，其次是磷，再次是锌，氮、磷、锌三者配合施用，可以有效降低水稻苗期养分等环境胁迫，有利于幼苗生长。

3 小结与讨论

根系是植株吸收营养物质的重要部位，对养分供应状况敏感。根系可以通过调节自身结构而适应外界养分供应状况，从而调节对水分和养分的吸收与运输而完成生长发育。叶绿素a是植物进行光合作用的主要色素，其含量高低在一定程度上反映了光合作用水平的高低，进而反映了植株生长状况[13]。本研究表明，氮、磷、锌3个试验因子中，氮对水稻株高和叶绿素a含量起主要效应，而磷对根系生长的影响要大于氮和锌。与单施氮肥相比，氮磷、氮锌配合施用有利于增加水稻叶绿素含量和根系活力，促进水稻株高的增加，各处理中平衡供给氮磷锌肥（NPZn处理），水稻根长、根系活力、叶绿素a含量、株高均处于较高水平，表明平衡配合施用氮磷锌肥一方面可以有效增加水稻根系长度，提高根系活力，促进水稻对水分和养分的吸收，另一方面有效地提高了叶绿素a含量，增强了光合作用，从而促进水稻幼苗的生长，增加了水稻植株高度。

SOD、POD、CAT、APX等是植物体内主要抗氧化酶，其主要功能是清除植株体内ROS和过氧化物，保护植株免受氧化胁迫损伤[14]。当植物处于逆境条件下，如温度、水分、养分胁迫促使活性氧增加，SOD作为植物体内抵御氧化胁迫的第一道防线，其合成表达能力此时会增强[15]，以催化O2-·转化为O2和H2O2，清除胁迫产生过多的O2-·。同时广泛存在于植物组织中的POD、CAT、APX合成表达也增强，以清除细胞内由SOD产生的H2O2，维持细胞H2O2的平衡，从而保持膜结构的稳定。本试验结果表明，氮、磷、锌及其任意两者或三者配合施用，水稻叶片中SOD、POD、CAT、APX活性均显著低于CK处理，并且4个含氮处理的SOD、POD、CAT、APX活性均低于4个无氮处理，4个含氮处理中，NZn、NP处理4种酶活性均高于N处理，SOD、CAT活性表现为NP>NZn>N>NPZn，POD、APX活性表现为：NZn>NP>N>NPZn；4个无氮处理中SOD、POD活性表现为CK>Zn>PZn>P，CAT活性表现为CK>PZn>P >Zn，APX活性表现为CK>Zn>P>PZn。所有处理中，均以NPZn处理SOD、POD、CAT、APX活性最低。说明水稻苗期施用氮肥对于缓解作物来自养分等的环境胁迫具有重要作用，其次是磷和锌。与单施氮肥相比，在施用氮肥的基础上单一增施磷或锌肥，可能会使作物对养分的吸收处于一种相对不平衡的状态，从而产生养分胁迫，引起SOD、POD、CAT、APX活性升高，而氮磷锌肥配合施用（NPZn处理）使水稻对养分的吸收处于一种相对平衡的状态，来自养分等的环境胁迫较低，此时细胞内ROS的产生和清除也处于相对较低的平衡状态，水稻叶片内SOD、POD、CAT和APX合成表达较低，其活性也就相对较低。

参考文献：

[1] 王晓波，宋凤斌，张 磊，等.施锌量对吉林省中部地区水稻生育的影响[J].吉林农业大学学报，2004，26（6）：591-595.

[2] 王 敏，赖 文，焦鲁英，等.杂交水稻施用锌、钼微肥的效应分析[J].耕作与栽培，1999（6）：22-23.

[3] 杜新民，刘建辉，张秉奎.锌锰配施对小白菜产量和品质的影响[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2007，35（4）：159-163.

[4] 郑小林，赖雨玲.水培锌浓度对水稻生长发育的影响[J].湛江师范学院学报（自然科学版），1999，20（1）：6l-64.

[5] 王晓波，宋凤斌.锌对水稻种子萌发的影响[J].吉林农业大学学报，2006，27（2）：119-122.

[6] 徐晓燕，赵红军，杨肖娥.水稻缺锌与环境关系的研究[J].广东微量元素科学，2001，8（4）：l-4.

[7] 张志良，瞿伟菁.植物生理学实验指导[M].第三版.北京：高等教育出版社，2004.

[8] 李得孝，郭月霞，员海燕，等.玉米叶绿素含量测定方法研究[J].中国农学通报，2005，21（1）：153-155.

[9] GIANNOPOLITIS C N，RIES S K.Superoxide dismutases：I. Occurrence in higher plants[J]. Plant Physiology，1977，59（2）： 309-314.

[10] RAO M V，PALIYATH G，ORMROD D P，et al. Influence of salicylic acid on H2O2 production， oxidative stress，and H2O2-metabolizing enzymes.Salicylic acid-mediated oxidative damage requires H2O2[J]. Plant Physiology，1997，115（1）： 137-149.

[11] RAO M V，PALIYATH G，ORMROD D P.Ultraviolet-B-and ozone-induced biochemical changes in antioxidant enzymes of arabidopsis thaliana[J]. Plant Physiology，1996，110：125-136.

[12] 张志良，瞿伟菁，李小方.植物生理学实验指导[M].第4版.北京：高等教育出版社，2009.

[13] CHU L，LIU D Y，WANG Y B，et al.Separate and combined effects of Cu and Cd on seeding growth and active oxygen metabolism system of Trifolium repens L.[J].Frontiers in Bioscience，2006，11：2861-2867.

[14] 王 伟，杨 野，郭再华，等.铝胁迫对不同耐铝小麦品种根生理结构及活性氧代谢酶的影响[J].华中农业大学学报，2010， 29（6）：715-720.

[15] BASU U，GOOD A G，TAYLOR G J.Transgenic Brassica napus plants overexpressing aluminum-induced mitochondrial manganese superoxide dismutase cDNA are resistant to aluminum[J]. Plant and Cell Environment，2001，24：1269-1278.