白藜芦醇对常见肠道病毒抑制作用的实验研究

王玉涛，招穗珊，关文达，李润峰，杨子峰，王新华

1.广州医科大学附属第一医院呼吸疾病国家重点实验室，广东 广州510230 2.广州医科大学，广东 广州510182

白藜芦醇对常见肠道病毒抑制作用的实验研究

王玉涛1，招穗珊2，关文达1，李润峰1，杨子峰1，王新华2

1.广州医科大学附属第一医院呼吸疾病国家重点实验室，广东 广州510230 2.广州医科大学，广东 广州510182

目的：观察白藜芦醇体外对多种肠道病毒的抑制药效，为进一步探讨其抗肠道病毒谱提供依据。方法：采用细胞病变抑制法（Cytopathic effect inhibition Assay，CPE）和四甲基偶氮唑蓝（MTT）法，通过计算病毒抑制率、药物半数有效浓度（IC50）及选择指数（selection index，SI），研究白藜芦醇体外对抗多种肠道病毒的作用效果。结果：肠道病毒属（EV）11、EV71、EV84、柯萨奇病毒（COX）B3和COX A10等5种病毒的TCID50分别为：2.13×10-4，1×10-4，2.13×10-6，1×10-5及4.67×10-4。白藜芦醇在Vero E6细胞的半数毒性浓度TC50为50μg/mL。白藜芦醇最大无毒浓度为25μg/mL，以此为抗病毒活性检测的起始浓度。在最大无毒浓度下，白藜芦醇与阳性对照药对5种肠道病毒均有抑制作用。除EV84病毒外，白藜芦醇的抑制率均高于阳性药物利巴韦林。结论：白藜芦醇体外具有抗多种肠道病毒作用，对于病毒性肠道传染病防治具有一定应用前景。

白藜芦醇；肠道病毒；体外试验

肠道病毒属于小RNA病毒科（Picornaviridae）中的肠道病毒属（Enterovorus，EV），人类是肠道病毒唯一的天然宿主，主要通过粪口途径传播［1～2］。临床症状轻者表现为倦怠、乏力、低热等，重者可全身感染，脑、脊髓、心、肝等重要器官受损，预后较差，并可遗留后遗症或造成死亡，特别是婴幼儿患者可以爆发严重的脑炎、心肌炎或重症肺炎［3～5］。目前临床尚无有效抗肠道病毒药物，进行临床研究的普来可那立是代谢稳定的病毒衣壳功能抑制剂，具有广谱的抗肠道病毒和鼻病毒活性，并且口服效果较好，但由于不良反应，尚未获得批准［2］。

白藜芦醇（resveratrol），化学名称为3，4’，5-三羟基-二苯乙烯，是一种植物抗毒素，目前至少已经在21个科、31个属的72种植物中发现了白藜芦醇，包括决明、葡萄，花生、虎杖等［6～8］。近年研究发现，白藜芦醇具有多种生物学活性，包括抗炎、抗细菌和真菌、抗血小板凝集、调节脂质代谢、保护心血管、抗肿瘤、抗肝炎病毒、单纯疱疹病毒和EB病毒等作用［9～10］，尤其是，白藜芦醇的抗病毒作用受到广泛关注，一直是其生物活性研究的热点之一。本课题组前期已发现白藜芦醇对于可引起呼吸道和消化道感染的腺病毒具有较好效果［11］，为了进一步探讨其对肠道病毒的抑制作用，本研究选择了EV11、EV71、EV84、柯萨奇病毒（Coxsackievirus，COX）B3和A10为观察对象，研究白藜芦醇的体外抗肠道病毒作用，为该类病毒的临床用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 白藜芦醇（粉末状，纯度为98.55%，购自西安冠宇生物技术有限公司）。利巴韦林，购自广州肇庆星湖医药有限公司，批号：L071015。

1.2 毒株与细胞 肠道病毒（EV11、EV71、EV84、COX B3、COX A10）等均为呼吸疾病国家重点实验室病毒室临床分离株，经特异性引物扩增测序鉴定。上述毒株于Vero E6细胞传代，在37℃，5%CO2条件下培养，以细胞病变法计算半数感染量（TCID50）。常规CPE法测定5种肠道病毒EV11、EV71、EV84、COX B3和COX A10病毒对Vero E6细胞的病毒半数感染剂量（TCID50）［11］。

1.3 白藜芦醇的细胞毒性试验 按每孔约2.5×104VeroE6细胞接种到96孔板，24～36 h后待细胞长成单层，弃去培养液，加入不同稀释度（2倍）的药物100μL/孔，空白对照和正常细胞对照孔加入100μL/孔MEM，37℃，5%CO2继续培养48 h，每孔加MTT溶液（5 mg/m L）20μL，置37℃，5% CO2温箱中继续孵育4 h。吸弃上清液，每孔加100μL二甲基亚砜（DMSO），低速振荡10m in，使结晶物充分溶解。选择490 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值。按照用Reed-Muench法［12］计算药物半数有毒浓度（TC50）。

1.4 白藜芦醇的体外抗肠道病毒药效96孔细胞培养板内的Vero E6细胞先孵育肠道病毒（EV11、EV71、EV84、COX B3和COXA10）2 h，同时设定阳性药物（利巴韦林）和细胞对照，在最大无毒浓度条件下，加入不同浓度药物（除阳性和阴性对照外）在37℃、5%CO2环境下培养。每天在倒置显微镜下观察细胞病变（CPE）并记录。试验时设阳性药物对照、正常细胞对照及病毒对照。细胞出现病变程度按以下6级标准记录：-为细胞生长正常，无病变出现；±为细胞病变少于整个单层细胞的10%；+为细胞病变约占整个单层细胞的25%；++为细胞病变约占整个单层细胞的50%；+++为细胞病变约占整个单层细胞的75%；++++为细胞病变约占整个单层细胞的75%以上［13］。当病毒对照组CPE为+++～++++时，用M TT法测定所有组的细胞存活数，试验重复3次，根据公式［12］计算白藜芦醇对5种肠道病毒的抑制率。病毒抑制率=（试验组平均OD值-病毒对照组平均OD值）/（细胞对照组平均OD值-病毒对照组平均OD值）×100%［14］。

1.5 统计学方法 数据分析采用SPSS12.0软件进行数据处理、统计，用药物组吸光度与对照组吸光度作单因素方差分析。

2 研究结果

2.1 病毒TCID50测定结果EV11、EV71、EV84、COX B3和COX A10等5种病毒的TCID50分别为：2.13×10-4，1×10-4，2.13×10-6，1×10-5及4.67×10-4。

2.2 白藜芦醇的细胞毒性试验结果 白藜芦醇在Vero E6细胞的半数毒性浓度TC50为50μg/m L。白藜芦醇最大无毒浓度为25μg/m L，以此为抗病毒活性检测的起始浓度。

2.3 白藜芦醇体外抗肠道病毒药效比较 见表1、表2。在最大无毒浓度下，白藜芦醇与阳性对照药对5种肠道病毒均有抑制作用。除EV84病毒外，白藜芦醇的抑制率均高于阳性药物利巴韦林。

表1 白藜芦醇体外抗肠道病毒药效比较

表2 白藜芦醇对常见肠道病毒致病变半数有效浓度（IC50）及选择指数（SI）比较

3 讨论

肠道病毒所含血清型众多，是引起手足口病的主要病原体，包括EV71（Enterovirus71），COX A组和B组，其中EV71可引起神经系统方面的并发症，且病情较重［15］，而COX可引起急、慢性心肌炎，少数病人有进行性心衰、心率失常等表现［16］，对人类健康产生重大影响。由于目前临床并无有效疫苗或药物，研发相关的抗病毒药物极其迫切。

传统植物药材应用广泛且历史悠久，为抗病毒药物开发提供了重要资源，从中发现挖掘新型有效的抗病毒药物具有重要意义和价值，同时对于解决化学药物引起的耐药性和副作用提供了新的选择。白藜芦醇，1940年由日本学者从毛叶芦藜的根部提取到［7］，是一种含有芪类结构的非黄酮类化合物，目前已在多种植物中发现，有报道其对流感病毒有较好的抑制作用，主要机理是通过干预流感病毒vRNP在细胞核与细胞质之间转移以及抑制宿主细胞protein kinase C（PKC）活性及其依赖的相关通路而发挥抗病毒作用，体内药效显示其可有效改善感染流感病毒小鼠的存活率以及降低肺组织病毒滴度［17］。

本实验初步探讨了白藜芦醇体外对多种常见肠道病毒的活性，证实白藜芦醇在Vero细胞中有一定的抗肠道病毒的活性，其中在25μg/m L浓度下，对EV71、COXB3、COXA10的病变抑制率均达到96%以上，具有一定的广谱性，尤其是在目前缺乏抗肠道病毒药物的条件下，为白藜芦醇作为候选药物用于抗肠道病毒的研究提供一定的理论支持。下一步将继续研究其抗肠道病毒的药理机制，对不同肠道病毒药效差异性及是否存在相同的机理，以及该药物对宿主细胞是否也有一定的影响，包括各种宿主细胞通路等，从而较完整的阐明白藜芦醇的抗病毒活性和特点。

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（责任编辑：骆欢欢）

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A

0256-7415（2015）02-0222-03

10.13457/j.cnki.jncm.2015.02.104

2014-09-15

国家自然科学基金-广东联合基金项目（U1201227）；广州市教育系统创新学术团队项目（13C07）；广州市科技计划项目-科技惠民专项项目（2014Y2-00031）；广州市健康医疗协同创新重大专项项目（201400000002）

王玉涛（1981-），男，助理研究员，研究方向：中药抗病毒。

王新华，E－mail：xinhuaw@gzhmu.edu.cn。