不同种群比格犬单核细胞、T淋巴细胞检测

刘　宏， 王　冰， 黄　凯， 项路娟， 孙红梅， 尹燕博，

（1. 青岛农业大学， 青岛 266109； 2. 青岛大学医学院， 青岛 266071；3. 青岛博隆实验动物有限公司， 青岛 266225）

不同种群比格犬单核细胞、T淋巴细胞检测

刘宏1， 王冰2， 黄凯3， 项路娟3， 孙红梅3， 尹燕博1，3

（1. 青岛农业大学， 青岛 266109； 2. 青岛大学医学院， 青岛 266071；3. 青岛博隆实验动物有限公司， 青岛 266225）

目的 检测3个种群健康成年比格犬外周血单核细胞及T淋巴细胞免疫表型分布，建立相应的正常参考范围。方法 选择三个种群健康成年比格犬： Charles River（大体型）、Covance（中体型）、自繁（小体型）各30只，血样用三色特异性T淋巴细胞亚群及单色单核细胞荧光抗体进行荧光标记，流式细胞仪检测CD14、CD3、CD4、CD8标记的样品。结果 （1）外周血白细胞中单核细胞占比大体型比格犬明显高于其他两组（P＜0.05）； （2）CD4+淋巴细胞在T淋巴细胞中占比大体型比格犬明显高于其他两组（P＜0.05）； CD8+淋巴细胞在T淋巴细胞中的占比中体型比格犬明显高于其他两组（P＜0.05）； CD4+/CD8+小体型明显高于其他两组（P＜0.05）。结论 大体型比格犬自身免疫能力比较强，小体型比格犬具有数据比较稳定、体型小、容易操作等优点。建立了不同种群比格犬的淋巴细胞免疫表型及单核细胞的参考范围。

比格犬； 单核细胞； T淋巴细胞； 流式细胞术； 免疫细胞

随着艾滋病、自身免疫疾病及各种肿瘤的发病率上升，人们对这些疾病的发病机理、病程发展、治疗效果的研究不断深入，研究表明疾病的发生与机体免疫功能状态密切相关［1，2］。

目前主要以小鼠模型来研究人类疾病，但小鼠生命周期短，不适合作为慢性疾病模型，利用犬作为动物模型则克服了小鼠的上述缺点［3］。在国内外的科研工作中，比格犬被广泛应用于医学、生物学、病理学、肿瘤学、免疫学、药理学、生物化学等生命科学领域［4］。比格犬对于阐明人类相关疾病的发生机制、筛选治疗药物并最终控制和治疗人类疾病方面无疑是很好的动物模型。

但在正常情况下，比格犬外周血淋巴细胞亚群及单核细胞的变化规律怎样？特别是不同种群比格犬的相应指标是否一致，目前还没有相关文献报道。本文目的是建立正常比格犬各个种群的外周血淋巴细胞免疫表型及单核细胞正常参考范围，为动物模型的建立奠定基础。

1　材料与方法

1.1实验动物

12月龄以上Charles River（大体型）、Covance（中体型）、自繁（小体型）比格犬各30只， 雌雄各半，体质量分别为17～23 kg、13～17 kg和9～12 kg，均由青岛博隆实验动物有限公司提供［SCXK（鲁）2012-0003］。

1.2仪器与试剂

水平离心机（TD5A， 湖南赫西仪器装备有限公司）、涡旋振荡器（SK-1， 上海梅香仪器有限公司）、流式细胞仪（Accuri C6，美国BD公司）； FITC标记的CD14鼠抗犬单抗、APC标记的CD3鼠抗犬单抗、PE标记的CD4鼠抗犬单抗、FITC标记的CD8鼠抗犬单抗、溶血素等均为美国BD公司的产品。

1.3方法

每只比格犬前肢内侧静脉处采抗凝血2 mL，均在6 h内处理样品。 取100 μL抗凝全血加入每支试管中，注意不要碰到管壁。轻轻混匀，加入20 μL荧光抗体，室温避光保存20 min。取出试管，每管加入10倍稀释的溶血素2 mL， 涡旋混匀，避光10 min， 300×g离心5 min， 弃去上清液。每管加入2 mL PBS，涡旋混匀， 300×g离心5 min，弃去上清液。然后加入0.5 mL PBS混匀，4 ℃避光1 h内上机检测。

1.4统计分析

将有效数据导入电脑， 采用SPSS 17.0 软件包和Excel进行统计分析。数据以±s表示，多组间的比较用方差分析，两两比较用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1单核细胞

不同种群比格犬间单核细胞在白细胞中占比有显著性差异（P＜0.05）（表1）。大体型比格犬单核细胞数量最多。

2.2T淋巴细胞

不同种群比格犬CD4+、CD8+细胞在T淋巴细胞中占比有显著性差异（P＜0.05），大体型与小体型及中体型与小体型比格犬间CD4+/CD8+有显著性差异（P＜0.05）， 大体型与中体型间无显著差异（P＞0.05）（表1）。

2.5非单核细胞系、非淋巴细胞系

不同种群比格犬非单核细胞系、非淋巴细胞系间无显著差异（P＞0.05）（表1）。

表1　不同体型成年健康比格犬外周血CD14+单核细胞、T淋巴细胞等检测结果 %

3　讨论

健康比格犬外周血淋巴细胞亚群正常参考范围建立，是监测和评价机体免疫功能的基础，对疾病诊断分期、治疗评价、预后判断有重要指导意义。利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面的抗原结合， 再配合多色荧光染料， 通过流式细胞仪检测分析即可以把各种不同功能的淋巴亚群区分开来，进而得到各亚群的相对比例［5，6］。最常检测的细胞包括T细胞（CD3）、单核细胞（CD14）、辅助性T细胞（CD3+、CD4+）和抑制性T细胞（CD3+、CD8+）等［7］。淋巴细胞是机体免疫细胞中构成免疫系统和发挥适应性免疫应答，执行免疫功能主要细胞群体［8］。对淋巴细胞亚群的检测现已广泛应用于肿瘤、艾滋病和自身免疫病的诊断、治疗及预后［9］。此外，外周血单核细胞在机体免疫防御和固有免疫应答中发挥重要作用。单核细胞除了抵御侵入体内的病原体外，还能吞噬和清除机体代谢过程中不断产生的衰老、死亡或恶变细胞以及颓变物质等，从而维持内环境稳定［11］。进行淋巴细胞亚群及单核细胞的分析，对于了解机体免疫功能状态有重要的临床意义。单核细胞来源于骨髓细胞的多功能干细胞。单核细胞是机体重要的杀伤肿瘤细胞的免疫细胞，是树突状细胞和巨噬细胞的前体细胞。具有吞噬杀伤、呈递抗原启动免疫应答、抗肿瘤、调节免疫等作用［11］。单核细胞表达高水平的CD14分子，是较为特异的表面标志［12］。目前有多种T细胞分类法，按T细胞表面是否存在CD4和CD8分子进行分类，可将T细胞分为T4细胞和T8细胞。CD3是比较特异的T细胞抗体，表达于所有T细胞表面；CD4+T细胞具有辅助、诱导细胞及体液免疫的作用； CD8+细胞具有细胞毒效应，也发挥抑制细胞及体液免疫的作用［13］。CD8+T细胞计数能反映机体抗病毒能力。外周血中CD4+T细胞与CD8+T细胞的比值可以评估淋巴细胞的功能，CD4总数升高提示淋巴细胞活性增加，因为辅助性细胞占优势， 而CD8总数升高则提示淋巴细胞活性降低［14］。

本研究选择比格犬的三个种群分别为大体型、中体型和小体型。大、中、小体型比格犬的体质量分别为： 17～23 kg、13～17 kg、9～12 kg。大体型、中体型比格犬有详细的遗传图谱，小体型是在以上两种体型的基础上自繁自育形成体型较小的比格犬。单核细胞在机体免疫防御和固有免疫应答中发挥重要的作用。不同体型间在外周血单核细胞、粒细胞、淋巴细胞在白细胞中占比的比较中，大体型单核细胞在白细胞中占比最高，小体型比格犬单核细胞在白细胞中占比仅次于大体型比格犬单核细胞在白细胞中的占比，中体型比格犬单核细胞在白细胞中的占比最低。

在日常饲养管理中， 大体型和小体型比格犬的成活率较高， 抵抗能力较强， 而中体型比格犬在相同的饲养条件下成活率最低， 抵抗力较弱， 此现象与研究结果相符合。淋巴细胞亚群分类占比中小体型成年健康比格犬数据比较稳定更接近于人类的占比。

参考人类外周血细胞流式物理参数图［15］并结合本研究得出非淋巴细胞系、非单核细胞系是粒细胞系并且比格犬的单核细胞要比淋巴细胞小。而夏兆飞等［16］在《犬猫血液学手册》中提到犬单核细胞大小为15～20 μm，淋巴细胞为9～12 μm，即单核细胞要比淋巴细胞大，与本研究结果不一致。单核细胞比淋巴细胞小，是否为比格犬所特有，有待进一步研究。张改平等［17］提到犬类T淋巴细胞在白细胞中占比为46%～72%； CD4+T细胞在淋巴细胞中占比为27%～33%； CD8+T细胞在淋巴细胞中占比为17%～18%； CD4+/CD8+比值为1.7，而本研究中CD4+T细胞在白细胞中占比及CD4+/CD8+比值均比上述中要高，具体原因有待进一步研究。周祥吉等［18］提到24只南方杂种犬的数据与本研究小体型比格犬的数据相符。

总之，此次试验成功建立了健康比格犬不同种群外周血T淋巴细胞亚群及单核细胞的正常参考范围，对相关应用研究有一定参考意义。

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Q95-33

B

1674-5817（2015）06-0495-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.06.013

2015-05-16

“十二五”农村领域国家高技术研究发展计划（863）项目（2012AA101303）

刘宏（1988-）， 女， 硕士， 主要从事预防兽医学研究。 E-mail： liuhong_22188@163.com

尹燕博。E-mail： yanboyin2011@163.com；王冰。E-mail： wangbing@qdu.edu.cn