肺不张后复张小型猪肺泡表面活性物质A的表达及CT比较

涂军伟， 王赛斌， 盛怡俊， 陈慧君， 田江华， 盛　琳， 应明亮， 胡　斌， 何忠平

（1. 金华市中心医院呼吸科， 金华321000； 2. 金华市中心医院影像科， 金华321000；3. 金华市中心医院病理科， 金华321000； 4. 金华市食品药品检验所， 金华321000）

肺不张后复张小型猪肺泡表面活性物质A的表达及CT比较

涂军伟1， 王赛斌1， 盛怡俊1， 陈慧君1， 田江华1， 盛琳1， 应明亮2， 胡斌3， 何忠平4

（1. 金华市中心医院呼吸科， 金华321000； 2. 金华市中心医院影像科， 金华321000；3. 金华市中心医院病理科， 金华321000； 4. 金华市食品药品检验所， 金华321000）

目的探讨肺不张后复张过程中小型猪肺泡表面活性物质A（SPA）的表达及多层螺旋计算机断层扫描（CT）影像学变化。方法采用18只中国实验用小型猪I系为实验动物，在支气管镜下置入封堵器造成肺不张模型，分别在肺不张后3 d、1周及2周取出封堵器，运用CT观察各组肺复张情况，在取出封堵器后2周取实验肺组织，采用免疫组织化学检测SPA的表达。结果SPA在肺不张2周组表达下降，与3 d组、1周组比较存在统计学差异（P＜0.05）。CT下比较3组单侧肺不张面积无统计学差异（P＞0.05），而在复张过程中，3 d组残留肺不张面积最少，与1周组、2周组比较存在统计学差异（P＜0.05）。取出封堵器后，肺不张1周、2周组之间CT弧度值无明显差异（P＞0.05），但均高于3 d组（P＜0.05）。结论肺复张后SPA表达随肺不张时间延长而减少；肺不张后肺复张CT影像学改善取决于发生肺不张时间，此时间在一周内为佳。

肺不张； 复张； 肺泡表面活性物质A（SPA）； 计算机断层扫描（CT）； 弧度值

任何原因引起的肺组织不含气或含气量减少，以致肺组织萎陷，体积缩小，称作肺不张（Atelectasis）。肺不张不是一个独立的疾病名称，是由多种疾病所引起的一种病理形态学改变。近年来肺不张的病因、诊断及治疗方面均有重大突破，大部分肺不张患者经治疗后能复张。然而，关于肺不张后肺复张所需时间及复张过程中影像学动态变化及相关机制研究未见报道。本研究通过建立肺不张后复张动物模型，研究不同时期肺不张在解除不张后肺泡表面活性物质A（SPA）的表达、影像学动态变化和组织病理学改变，初步探讨了治疗肺不张的最佳时机。

1　材料与方法

1.1实验动物

1.2主要仪器及试剂

XZ-3型纤维支气管镜（上海）； H-600型透射电镜（HITACH，Japan）； 16排螺旋CT（西门子）； 镍钛合金封堵器购自上海形状记忆合金材料有限公司。SPA多克隆兔抗猪一抗、鼠抗兔二抗及其他免疫组织化学用试剂购自武汉博士德生物技术有限公司。

1.3模型建立

小型猪麻醉前10 h禁食不禁水，氯胺酮针剂8～10 mg/kg肌肉内注射全身麻醉， 小型猪约10 min后站立不稳，抬置活动操作台上束缚固定，配合体积分数为2%利多卡因局部浸润和气道黏膜表面麻醉，丙泊酚针全身麻醉。按以下步骤操作： ①纤支镜经鼻插入达右主支气管下端，沿支气管镜活检工作孔道将导引钢丝送入靶位支气管腔内，留置导丝退出支气管镜。②改用外径为3.2 mm的纤维支气管镜， 从另一鼻孔插入， 并伸至拟封堵的靶位支气管上方， 以监视整个封堵器的置人和释放。③将外鞘沿导引钢丝送入到拟封堵的靶位支气管上方， 调整外鞘管至最佳位置后， 固定外鞘管退出导丝。④将收拢的连接有推送杆的镍钛合金封堵器沿外鞘管腔内送至靶区后， 直视下将封堵器释放至靶位，在确认封堵器处于最佳位置并待其充分膨胀后卸除推送杆，撤出推送杆和外鞘管，至此整个封堵过程完毕，退出支气管镜。

小型猪支气管封堵成功后每3 d一次行胸部计算机断层扫描（CT）检查， 直至胸部CT显示出现肺不张的表现。将已经造成肺不张的小型猪于形成肺不张后3 d、1周、2周， 在支气管镜下使用冰生理盐水喷洒后将支气管封堵器取出， 恢复支气管通气。并在取出后每3 d行胸部CT检查观察肺复张情况，直至2周结束。实验末取实验肺组织行相关检测。

1.4实验方法

1.4.1HE染色在设定时间点取实验部位肺组织标本，质量分数4%多聚甲醛浸泡固定，常规石蜡包埋、切片，常规H E染色，光镜检查。

1.4.2SPA免疫组织化学检测免疫组织化学组织切片脱蜡至水，微波抗原修复，加入SPA多克隆兔抗猪一抗后4 ℃过夜，加入鼠抗兔二抗，苏木素复染，脱水、透明、封片，光镜观察。空白对照用PBS代替一抗，阳性对照为成人肺组织切片。以细胞胞质有棕黄色颗粒沉着为阳性细胞。阳性结果按下列方法分级： 无反应颗粒（-）； 阳性细胞分散且表达弱阳性（±）； 表达强度阳性（+）； 表达强度中等阳性（++）； 表达强阳性（+++）。SPA表达阳性细胞计数分组中每例标本各随机抽取染色清晰的切片5张，每张切片于高倍镜（×400） 随机选取5个视野，固定窗口面积，进行细胞计数。

2017年，全市水产品总产量为6.77万吨，其中养殖产量6.16万吨，捕捞产量0.61万吨。养殖品种为鲢、鳙、鲤、鲫、草、青、鳊鲂等大宗鱼类和黄颡鱼、鲈、黄鳝、鳜、泥鳅、鲶、鮰等优质鱼类，产量为6.00万吨，虾、龟鳖、大鲵等特色品种产量0.16万吨。

1.4.3不同时期肺不张及复张CT检查每组实验动物在规定时间行CT横断面和冠状面检查，在同一横断面在规定时间测定各组CT弧度值（Hu）。每组取6个层面，每个层面计算5个CT Hu，测量值用取均数和标准差表示。在同一层面，分别测量每组肺不张面积占单侧肺面积比值，复张后残留肺不张面积占单侧肺面积比值，用百分数表示。

1.5统计学分析

2　结果

2.1肺组织病理学观察

正常肺组织肺泡壁结构较薄，肺泡内充满空气（图1A）； 肺不张组织光镜可见广泛肺泡膨胀不全，肺泡壁塌陷，肺泡内无气体，细支气管壁完整，毛细血管扩张、出血，细支气管和肺泡内充满中性粒细胞和组织细胞（图1B）。肺复张后上述不张改变明显减轻，但可见少许肺间质纤维化（图1C）。

2.2SPA表达

镜下表现为肺泡上皮细胞胞浆呈棕色深染（图2），肺不张3 d（图2A）至1周（图2B），SPA表达无明显差异（P＞0.05），肺不张2周组（图2C）SPA表达明显下降，与肺不张3 d、1周组比较均有统计学差异（Z=-2.889， P=0.004； Z=-2.567， P=0.001， 表1）。

2.3肺不张CT表现

肺不张区域的CT弧度值增高，伴肺体积缩小、叶间胸膜移位，支气管、血管聚集，邻近组织气管移位和代偿性肺气肿等， 可见空气支气管征（图3A～C）。肺复张组上述情况明显减轻，趋向正常， 或仅有少许密度增高病灶改变（图4A～B）。3组在肺不张CT弧度值及肺不张占单侧肺面积比较均无明显差异（P＞0.05，表2、3）， 而在复张2周后，1周组、2周组CT弧度值及残留肺不张占单侧肺面积均明显高于3 d组（P＜0.05，表2、3）。

表1　肺泡表面活性物质A免疫组织化学Table 1 Expression of pulmonary surfactant-associated protein A by immunohistochemistry

图1　小型猪肺组织病理学观察Figure 1 Pathological observation on lung tissue in minipig

图2　小型猪SPA免疫组织化学Figure 2 Immunohistochemistry of pulmonary surfactant-associated protein A in minipig

图3　小型猪CT冠状位及横断位肺不张表现Figure 3 Coronal and conventional CT scanning image of atelectasis in minipig

图4　小型猪CT肺复张表现Figure 4 CT scanning image of re-expansion after atelectasis in minipig

表2　不同时间肺不张及复张残留不张区域面积百分比Table 2 Comparsion area of atelectasis with residual atelectasis after re-expansion with time %

表3　不同时间肺不张及肺复张CT弧度值Table 3 Comparison CT value of atelectasis with residual atelectasis after re-expansion with time %

3　讨论

肺不张是临床上常见的综合征，如感染、异物、肿瘤、急性肺损伤、麻醉围手术期［1］、机械通气及溺水等均容易并发肺不张。近年来，在肺不张的病因、诊断及治疗方面均有重大突破，如支气管镜下介入治疗最为显著。目前开展的介入治疗包括：激光治疗、微波治疗、高频电治疗、氩等离子体凝固治疗、冷冻治疗、近距离放疗、气道支架治疗、球囊扩张治疗等［2-4］。目前对肺不张有较多研究［5，6］，但对于肺不张后肺复张的病理生理机制、治疗时机的把握及治疗策略的选择，目前无可靠依据可循。为此，本研究旨在此方面作进一步研究和初步探讨。

反应肺不张病理生理机制的动物模型已成功建立。国外有人在不同的动物种属复制了急性肺不张模型，这些动物包括猪、兔、犬等［6-9］，但其研究出发点多着重于肺不张的早期诊断及各种干预对肺不张的影响。建立肺不张模型的方法各有不同，Ferrante等［7］使用福格蒂导管携带球囊使其扩张阻塞支气管的方法复制肺不张模型， Comaru等［5］则通过导管在局部支气管内注入人工粘液复制肺复张的模型， 其他方法包括叶支气管的夹闭、气管镜下植入海绵栓等。此类动物模型在复制出肺不张后不能解除诱因，与临床肺不张治疗后肺复张的病例不同。中国实验用小型猪的比较医学研究表明： 猪在心血管系统、消化系统、皮肤结构、营养需要、矿物质代谢、多项生理生化值与人类有较大的相似性，猪用于人类疾病模型、药物学、中医学等多项领域研究优于其他实验动物。本文作者借助纤维支气管镜在叶气管内置入封堵器形成肺不张，然后在规定时间点取出封堵器致肺复张，成功复制了肺不张后复张的动物模型，该模型目前尚属于首创，为今后肺不张后复张研究提供动物模型参考。

CT检查是诊断肺不张最常规和有效的方法，普通的胸部X摄影不易发现，除非是大面积肺不张。CT上可见病变肺叶容积缩小且密度增高等。Strang等［10］提出肺不张胸部CT诊断标准： 通过测量弧度值Hu，肺部CT表现分成4种，-1 000 Hu到-850 Hu为过度充气： -850 Hu 到-500 Hu为正常充气；-500 Hu到-100 Hu为不全充气； -100 Hu 到+100 Hu为肺不张。本文作者制作的2周内肺不张模型CT值处于20～30 Hu，符合上述标准，为临床肺不张患者评估肺不张时间提供影像学参考。随着发生肺不张时间延长，复张延缓，本文作者研究结果提示，肺不张2周组解除肺不张后2周仍有部分肺组织膨胀不全，这可能与长时间肺不张导致肺泡上皮细胞损伤、气管壁破坏有关。

肺泡上皮细胞（AEC）包括肺泡Ⅰ型上皮细胞（AECⅠ）和肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECⅡ）， 其中AECⅡ是肺泡上皮细胞的原始干细胞，具有重要的生理功能。AECⅡ具有很强的分化、增生能力，在急性肺损伤时可以分化为AECⅠ，在转化生长因子（TGF）-β1的诱导作用下可以转化为间充质细胞、成纤维细胞［11］，从而起到增殖、修复肺组织损伤的作用。SPA是由肺泡Ⅱ型细胞分泌的一种脂蛋白，主要成分是二棕榈酰卵磷脂，分布于肺泡液体分子层的表面，具有广泛的生理学作用，如： 降低肺泡表面张力、增加肺的顺应性、维持大小肺泡容积的相对稳定、防止肺不张及防止肺水肿等。本文结果表明，肺不张后SPA表达下降，此过程在肺不张一周内不明显，而在两周时SPA表达下降显著，肺不张过程中SPA的表达下降可能是肺不张病理生理学的重要改变之一。提示在肺不张发生一周内尽早解除肺不张，有助于疾病预后改善。

基于上述研究，作者认为肺复张后SPA表达随肺不张时间延长而减少； 肺不张后肺复张CT影像学改善取决于发生肺不张时间，在一周内解除肺不张，肺复张改善良好。本研究存在一定的不足，如未能进一步研究时间超过两周以上的肺不张。此外，采用实验方法及检测指标不够全面，尚未进一步探讨不同时间肺不张分子生物学机制及有效的干预手段，此亦即本研究值得进一步深入的方向。

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Expression of Pulmonary Surfactant-associated Protein A and CT Imaging in Lung Re-expansion Minipig after Atelectasis

TU Jun-wei1， WANG Sai-bin1， SHENG Yi-jun1， CHEN Hui-jun1， TIAN Jiang-hua1，SHENG Lin1， YING Ming-liang2， Hu Bin3， HE Zhong-ping4
（1. Department of Pneumology， 2. Department of Radiology， 3. Department of Pathology，Jinhua Municipal Central Hospital， Jinhua 321000， China； 4. Jinhua Municipal Institute for Food and Drug Control， Jinhua 321000， China）

Objective To investigate the expression of Pulmonary surfactant-associated protein A （SPA） and the CT imaging in lung re-expansion after atelectasis. Methods The minipig model of lung re-expansion after atelectasis was established. Male China Experimental Miniature Pig-I were randomly divided into three-days atelectasis group （3 d）， one-week atelectasis group （1 week） and two-weeks atelectasis group （2 weeks）， respectively （n=6）. Pigs were euthanized after two weeks of lung re-expansion. The expression of SPA of experimental lung tissue was detected by immunohistochemistry. At specified time point， CT value and imaging changes were measured. Results The expression of SPA was lower in 2 weeks group than that in the other two groups （P＜0.01）. The CT value was lower in 3 d group than that in the other two groups （P＜0.01）， and the degree of lung re-expansion was the highest level in 3 d group among three groups. Conclusions The SPA expression of experimental lung tissue was decreased with atelectasis prolonged. The CT imaging indicated that improvement of lung re-expansion was dependent on the time of the atelectasis and the preferable opportunity of atelectasis cure was within one week.

Atelectasis； Re-expansion； Pulmonary surfactant-associated protein A（SPA）； CT value

Q95-33

A

1674-5817（2015）06-0436-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.06.002

2015-06-15

浙江省科技计划项目（2012C37090）

涂军伟（1972-）， 男， 硕士， 主任医师， 从事呼吸内科专业。E-mail： tujw2008@126.com

王赛斌（1982-）， 男， 硕士， 主治医师， 从事呼吸内科专业。E-mail： wsaibin@126.com