右归饮对去卵巢血管钙化大鼠NMDAR1蛋白表达的影响*

黎波　龚向京　何虹材　况珊　楚瑞阁#

（1江西中医药大学附属医院南昌330006；2江西中医药大学2014级硕士研究生南昌330004；3江西中医药大学2013级硕士研究生南昌330004）

·论著·

右归饮对去卵巢血管钙化大鼠NMDAR1蛋白表达的影响*

黎波1龚向京1何虹材2况珊3楚瑞阁1#

（1江西中医药大学附属医院南昌330006；2江西中医药大学2014级硕士研究生南昌330004；3江西中医药大学2013级硕士研究生南昌330004）

目的：观察右归饮对去卵巢血管钙化中谷氨酸受体变化的影响。方法：将40只远交群雌性大鼠（sprague dawley，SD）随机分为假手术组、模型组、低剂量组、高剂量组和辛伐他汀组，采用皮下注射华法令加维生素D3制备血管钙化模型，造模后，低剂量组、高剂量组分别给予右归饮浓缩液5.35 g/（kg·d）和16.05 g/（kg·d）灌胃，辛伐他汀组给予辛伐他汀混悬水溶液5.25 mg/（kg·d）灌胃，假手术组和模型组给予等量生理盐水，共12周；实验结束时采集血浆标本测定雌二醇及血脂四项，采用苏木精-伊红染色法（HE染色）观察动脉钙化的情况，并采用免疫印迹试验检测N-甲基-D-天门冬氨酸受体（NMDAR，NR）1蛋白的表达。结果：模型组大鼠雌二醇、甘油三酯含量和NR1蛋白表达降低，P＜0.05，低密度脂蛋白升高，P＜0.05；高剂量组和低剂量组雌二醇、甘油三酯含量升高，NR1蛋白表达增加，P＜0.05；高剂量组、低剂量组和辛伐他汀组低密度脂蛋白的含量降低，P＜0.05；辛伐他汀组雌二醇无变化，P＞0.05。结论：右归饮可抑制大鼠去卵巢血管钙化的形成，可能与提高雌激素水平和NR1蛋白的表达有关。

血管钙化；去卵巢；右归饮；NMDAR1；蛋白表达

血管钙化是指钙磷在血管壁的异常沉积，常发生在血管内膜和中膜层，是动脉粥样硬化的独立危险因素，其发生机理与血管平滑肌、内皮细胞、骨髓间充质干细胞以及造血干细胞相互作用，激活内皮损伤修复过程中相关骨形成相关信号有关，导致血管钙化的发生，目前认为血管钙化是一个类似于骨形成的主动、可逆转且可被调节的生物学过程［1～3］。在骨形成过程中，骨细胞通过谷氨酸信号介导类似中枢神经内长时程增强或抑制作用，在分子水平表现为“N-甲基-D-天门冬氨酸受体”（N-methyl-D -aspartate Receptor，NMDAR，NR）的激活和钙内流，并介导增加和/或激活“突触”后膜上或者相关联系细胞的“α-氨基-3羟基-5甲基-4异恶唑受体”（Alpha-Amino-3-Hydroxy-5-Methyl-4-Isoxazolepropionic Acid Receptor，AMPAR），随之增加受体的活性和谷氨酸介导的生理活性［4］。为了明确血管钙化过程中谷氨酸信号中NR1的作用以及右归饮对其的作用，本研究建立了去卵巢血管钙化大鼠模型并以右归饮干预，以明确NR1蛋白的表达情况以及相关指标的变化。现报告如下：

1　材料与方法

1.1实验动物无特定病原体（Specific pathogen Free，SPF）SD雌性大鼠40只，体重200～250 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物许可证号：SCXK（湘）2011-0003。

1.2试验药物及制备右归饮：熟地黄9 g，炒山药6 g，山茱萸3 g，枸杞6 g，炙甘草6 g，杜仲6 g，肉桂6 g，制附子9 g，按要求制备成生药浓度为1.594 g/ml的溶液，4℃保存备用；30%的华法令注射液：华法令（sigma，BJ121010351A，CAS号129-06-6），精密称取6 g华法令，加生理盐水200 ml，混匀至清澈透明，密闭，4℃避光保存备用；维生素K1注射液（国药准字H41021051）；维生素D3注射液（国药准字H31021259）；辛伐他汀片（国药准字H20083839）；辛伐他汀水溶液混悬剂的制备（浓度0.8 mg/ml）：称取羧甲基纤维素钠2.5 g，另取注射用水250 ml置于500 ml烧杯中，逐步加入羧甲基纤维素钠粉剂，放入磁力搅拌器搅拌90 min，若液体中有少许絮状物，超声处理10 min，使成透明溶液，另外将辛伐他汀片20片研细，置小烧杯中，加入注射用水20 ml，摇匀，将该容易加入羧甲基纤维素钠溶液中，超声处理10 min，使成白色均匀的混悬液，补足注射用水至500 ml，摇匀，密闭，4℃保存备用。

1.3试剂与仪器

1.3.1试剂NR1兔抗多克隆抗体（博士德生物，批号BA0612）100 KD；抗β-Actin鼠单克隆抗体（博士德生物）；SDS-PAGE凝胶配置试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号P0012A）。

1.3.2仪器均浆器，离心机，凝胶成像系统（美国UVP公司），全自动显微镜系统（德国Leica公司）。

1.4模型制备将SD雌性大鼠双侧去卵巢，饲养1周后，参考文献［5］制作血管钙化模型，均给予维生素K115 mg/（kg·d），皮下注射至第6天；第3天开始，血管钙化模型组另给予皮下注射维生素D330× 105U/（kg·d）至试验第5天和背部皮下注射华法令注射液150 mg/kg，q12 h至第6天，试验第7天造模完成。

1.5动物分组及处理将40只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、低剂量组、高剂量组和辛伐他汀组，每组8只。给药剂量参照文献［6］，造模结束后给予药物干预，共12周，其中假手术组和模型组给予相同体积生理盐水灌胃，1次/d；低剂量组和高剂量组给予右归饮溶液，按低剂量5.35 g/（kg·d），高剂量组16.05 g/（kg·d）给予灌胃。辛伐他汀组给予辛伐他汀水溶液混悬剂5.25 mg/（kg·d）灌胃［7］。均于第12周后，给予2%戊巴比妥钠腹腔麻醉（40 mg/kg）后开胸，心脏采血并获取主动脉到髂动脉组织。

1.6观察指标及方法

1.6.1血清和血浆标本的采集检测雌二醇（E2）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL），由江西中医药大学附属医院检测中心检测。

1.6.2病理切片沿胸主动脉上段同一部位取材约10 mm，置于10%多聚甲醛溶液中固定；石蜡包埋制成经主动脉横径的石蜡切片，连续切片4 μm厚，HE染色观察主动脉病变情况。

1.6.3免疫印迹试验检测NR1蛋白的表达另取余下胸主动脉髂动脉组织，用PBS冲掉残留在动脉腔和表面的血液，迅速置于经DEPC处理过的1.5 ml离心管中，冻存于-80℃的冰箱中，用于免疫印迹试验的检测。按试剂盒要求提取蛋白并测定蛋白浓度之后，取相同份量的蛋白用7.5%SDS-PAGE凝胶电泳分离后，用电转移法将蛋白质从SDS-PAGE凝胶转移至PVDF膜上，再用5%的脱脂奶粉在冰箱中封闭2 h后，依次加兔抗鼠一抗及抗兔二抗，孵育洗涤后采用化学发光法检测相关蛋白。凝胶成像分析系统进行灰度值扫描分析，灰度比（GSR）=（测得NR1强度×面积）/（内参蛋白β-Actin强度×面积），即NR1/actin灰度比值。

1.7统计学分析采用SPSS12.0统计软件包进行数据分析，计量数据以（±s）表示，各组数据间的比较采用单因素方差分析。

2　结果

2.1各组动脉形态学改变假手术组血管内皮细胞连接紧密、完整，内膜无增厚，中膜平滑肌细胞排列规则，分布均匀，未见泡沫细胞、钙化组织和软骨样组织；模型组血管大体可见整个主动脉节段性分布钙化灶，呈环形，质地较脆硬，HE染色可见血管内膜完整性消失，内膜下可见多核细胞以及软骨样细胞呈现铺路石样或线状排列，血管壁内膜下组织变性多向管腔隆起，沿着血管壁散在分布数个成簇样骨样堆积，病灶部位中膜结构消失，间有坏死物沉积，偶见病灶部位增殖性血管。右归饮干预高、低剂量组均可见内膜下少量多核细胞以及软骨样细胞呈现铺路石样或线状排列，血管壁内膜下组织变性明显减少，可见少许成簇样骨样堆积物（1～2个），病灶部位中膜结构扭曲或者挤压，管腔隆起较少。而辛伐他汀组血管钙化与模型组形态大体一致。

2.2各组大鼠血清雌二醇含量比较模型组雌二醇含量下降明显，差异明显，P＜0.05；高剂量组和低剂量组雌二醇的含量升高，纠正去卵巢后体内雌二醇的含量，与模型组比较，差异明显，P＜0.05；辛伐他汀组雌二醇含量并未升高，与模型组比较，无显著性差异，P＞0.05。见表1。

表1　各组大鼠血清雌二醇含量比较（pg/ml，±s）

表1　各组大鼠血清雌二醇含量比较（pg/ml，±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别n雌二醇假手术组模型组低剂量组高剂量组辛伐他汀组88888 762.29±283.35 235.04±89.32*430.91±87.08#*477.10±87.04#252.71±65.98*

2.3各组大鼠血清血脂含量比较模型组TG下降、LDL升高，与假手术组比较，具显著差异，P＜0.05；高剂量组TG升高，P＜0.05；高剂量组、低剂量组以及辛伐他汀组LDL含量下降，P＜0.05；TC和HDL在各组含量比较无明显差异，P＞0.05。见表2。

表2　各组大鼠血清血脂含量比较（mmol/ml，±s）

表2　各组大鼠血清血脂含量比较（mmol/ml，±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别nTCTGLDLHDL假手术组模型组低剂量组高剂量组辛伐他汀组88888 2.36±0.59 2.15±0.28 1.90±0.31 1.97±0.47 1.88±0.26 2.06±0.85 1.19±0.35*1.25±0.66 1.96±0.26#1.53±0.80 1.41±0.41 1.97±0.59*1.09±0.37#1.25±0.37#0.93±0.29#*0.96±0.48 0.84±0.37 0.55±0.18 0.72±0.17 0.65±0.18

2.4各组大鼠动脉硬化NR1蛋白表达比较模型组灰度明显下降，提示NR1蛋白表达减低，有显著差异，P＜0.01；高剂量组和低剂量组NR1蛋白表达升高，有显著差异，P＜0.01。见表3。

表3　各组大鼠血管组织NR1蛋白GSR的比较（±s）

表3　各组大鼠血管组织NR1蛋白GSR的比较（±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01。

组别nGSR假手术组模型组低剂量组高剂量组辛伐他汀组88888 0.235 2±0.024 6 0.060 8±0.003 8*0.112 2±0.007 6#*0.211 5±0.016 6#*0.057 0±0.004 6*

3　讨论

在血管钙化过程中，炎症反应、雌激素及血脂代谢等均影响其进程，而谷氨酸信号又介导类似中枢神经内长时程增强或抑制作用，促使局部钙磷沉积的扩大化。谷氨酸受体（glutamate receptors，GluRs）可分为离子型谷氨酸受体和代谢性受体两类，其中NR属于配体门控离子通道复合物，包括NR1、NR2A-2D和NR3三种亚型，均以异源性蛋白的多聚体形式存在［8］；NR激活可致Na+和Ca2+内流，K+外流。NR属于配体门控离子通道，是由不同的亚单位组成的四聚体或五聚体，编码这些亚单位的基因属3个家族：NR1、NR2（包括NR2A-D）和NR3（包括NR3A-B）。局部细胞NR是以NR1与一个或一个以上NR2和/或NR3亚基聚合的复合体。多受体亚基的复合体连同多种受体复合物成分并存的事实可以产生巨大谷氨酸受体功能多样性，并允许单一激动剂谷氨酸分别激活不同信号通路［9～11］，其中NR1是功能单位，NR2是调节单位。单独的NR2或NR3不形成功能性受体，只能和NR1聚合形成功能性聚合物，由不同亚单位组成的受体往往表现出不同的生理和药理学特性。NR主要是由NRl和NR2亚基构成的四聚体复合物。NRl是NR受体的基本亚基，是实现通道的功能所必须的，NR2起辅助NR形成多元化结构的作用。构成NR的亚基组织成2个双体（dimerofdimers），而受体的装配主要由亚基的N-端决定。NR1、NR2a和NR2b可以组成同源二聚体，这种同源二聚体也存在于由NR1和NR2构成的杂合NR中［12～13］。

对于血管钙化过程中谷氨酸信号的研究极少，最初的工作只是表明脑血管内皮细胞和心肌细胞表达有代谢型谷氨酸受体的表达［14～15］，进一步研究证明脑血管内皮细胞不但表达有Ⅰ型mGluR，而且具有抑制损伤引起的凋亡，通过mGluR维持膜不对称性抑制微血栓的形成［16～18］。另外，在脑膜微血管中存在mGluR1、mGluR2/3、mGluR4a、mGluR5和mGluR7［19］。本研究发现大鼠血管组织存在NR1的蛋白表达，在血管钙化组织中其含量明显降低，补肾中药右归饮可以提高血管钙化模型大鼠NR1蛋白表达水平并同时提高血清雌二醇含量，而且提高甘油三酯水平接近正常（与模型组比较差异明显），而辛伐他汀组既不能升高血清雌二醇含量，也不能改善NR1水平，但对低密度脂蛋白在低于正常水平时还进一步降低其含量，说明他汀类药物降脂具有单一方向性。这可能与右归饮多重调节功能有关，而辛伐他汀只能单一降低血脂组份。

本研究观察到去卵巢血管钙化模型大鼠雌激素含量明显下降，并伴有血清甘油三酯下降，与假手术组比较，P＜0.05，差异明显，而胆固醇和低密度脂蛋白变化无差异。说明在此钙化模型中血脂成分影响不大，而雌激素的下降可能充当一定的角色；中医学理论认为“天癸”渐绝标志着肾虚证形成，而肾阳虚证涉及神经-内分泌-免疫和神经-内分泌-骨代谢两大基因调控路线的紊乱［20］。女性原发性骨质疏松患者雌激素依肾气虚证、肾阴虚证、肾阳虚证逐渐降低［21］，男性冠心病肾阳虚证雌二醇明显降低［22］，表明雌激素缺乏后所表现的骨质疏松和冠心病等临床证候与中医的肾虚证密切相关。而雌激素缺乏可引起骨重建的偶联失衡，进而影响钙化进程，去卵巢大鼠可以在一定程度模拟雌激素缺乏的肾阳虚证。文献报道［23］补肾中药可提高雌激素等性激素水平以及性腺雌激素受体含量［24～25］。本次实验发现，去卵巢血管钙化大鼠，雌激素水平下降明显，而补肾中药右归饮可以提高雌二醇并改善NR1蛋白表达。提示右归饮对于肾虚血管病变具有一定的作用，在一定程度上验证了肾主骨生髓的理论。众所周知，雌激素缺乏会导致高代谢骨量丢失从而诱发骨质疏松，同时也发现雌激素缺乏大量并存血管钙化的现象，并与冠心病相关［26］，这种现象尚不能用“骨生长漂移学说”合理解释。因此，本实验推测，异位组织骨形成再现的血管钙化，应该存在一个更加精细的钙沉积平衡紊乱的适应性调节，这也许跟有谷氨酸信号通路中NR1聚合体的改变有关，这有待于进一步的定位实验来验证。

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Influence of Youguiyin on Expression of NMDAR1 Protein in the Vascular Calcification of Ovariectomized Rats

LI Bo1，GONG Xiang-jing1，HE Hong-cai2，KUANG Shan3，CHU Rui-ge1#
（1The Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang330006；2 2014 Master's Graduate of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang330004；3 2013 Master's Graduate of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang330004）

Objective:To observe the influence of Youguiyin on the changes of glutamate receptors in the vascular calcification of variectomized rats.Methods:Forty SD rats were allocated into the sham operation group，model group，low-dose group，high-dose group and simvastatin group.After the artery calcification models were established by subcutaneously injecting warfarin and vitamin D3，the low-dose group and high-dose group were gavaged with concentrated solution of Youguiyin by 5.35 g/（kg·d）and 16.05 g/（kg·d），the simvastatin group was gavaged with suspensions of simvastatin by 5.25 mg/（kg·d），and the sham operation group and model group were given equal amount of physiological saline，all for 12 weeks.At the end of the experiment，collected plasma samples for the determination of estradiol and serum lipids in four，observed the arterial calcification by hematoxylin and eosin staining method（HE staining），and used the immune blotting to detect the expression of N methyl D aspartic acid receptor（NMDAR，NR）1 protein.Results:The estradiol，triglyceride content and NR1 protein expression of the model group were decreased，P＜0.05，and the low density lipoprotein was elevated，P＜0.05.The estradiol，triglyceride content and NR1 protein expression of the high dose group and low dose group were decreased，P＜0.05. And in the high dose group，low dose group and simvastatin group，the low density lipoprotein content were decreased，P＜0.05.There was no change in the estradiol of the simvastatin group，P＞0.05.Conclusion:Youguiyin can inhibit the formation of vascular calcification in the ovariectomized rats；it may be related to the increases of the levels of estrogen and the expression of NR1 protein.

Vascular calcification；Ovariectomized；Youguiyin；NMDAR1；Protein expression

R363

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2015.12.001

2015-09-18）

江西省科技支撑计划（编号：20112BBG70033）；江西省自然科学基金（编号：20114BAB205082）

楚瑞阁，E-mail：384861926@qq.com