一种两亲性纤维素衍生物应用于毛细管电泳分离的研究

周海龙， 黄迪惠， 周 平*

(生物医学分析化学教育部重点实验室，武汉大学化学与分子科学学院，湖北武汉 430072)

高分子聚合物在毛细管电泳(CE)技术中发挥着重要作用，例如在毛细管凝胶电泳及无胶筛分毛细管电泳中以其作为筛分介质，而在毛细管电色谱中则可用作固定相。另外，高分子聚合物常用于毛细管的共价、动态或静态涂层。两亲性高分子聚合物的链中同时含有亲水和疏水两种基团，有些可表现出自组装性能，在医药、水处理、化妆品等领域具有良好的应用前景[1 - 4]。两亲性高分子聚合物因其在溶液中的独特性质也可用于CE分离，如Nakamura等利用聚(N-乙酰亚胺基)乙烯-聚(N-戊醇亚胺基)乙烯两亲性两嵌段共聚物分离酚类化合物[5]，Li等以丙烯酰胺和硅烷制备了两亲性聚合物用于DNA片段的分离[6]，Hwang等将聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯两亲性三嵌段共聚物用于DNA单链构象多态性分析[7]。

天然高分子化合物如纤维素、壳聚糖等通常具有生物相容性、生物可降解性、无毒、可再生和来源丰富等诸多优点，因此，基于天然高分子化合物制备两亲性聚合物及其自组装纳米胶束用作药物载体的研究近年来备受关注[8]。本研究对纤维素进行季铵化以及十二烷基化疏水改性，制备出新的两亲性纤维素衍生物，研究了其作为背景电解质添加物对不同荷电性质化合物的CE分离效果。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

P/ACE MDQ型毛细管电泳仪(美国,贝克曼公司)，配备二极管阵列检测器(DAD)；Mercury VX-300核磁共振仪(美国，瓦里安公司)；Vario EL Ⅲ元素分析仪(德国，艾力蒙塔公司)；F-4600荧光光度计(日本，日立公司)。

纤维素(棉短绒浆)由湖北化纤集团有限公司(湖北襄樊)提供，通过粘度法测得其粘均分子量(Mη)为11.2×104g/mol。3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵(CHPTAC，上海笛柏化学品技术有限公司)；溴代十二烷、苯乙酮、水杨酸、p-氨基苯磺酸、p-硝基苯甲酸(国药集团化学试剂有限公司)；苯丙酮、苯戊酮、磺胺、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺吡啶、乙酰水杨酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；苯丁酮(上海安耐吉化学有限公司)；苯己酮(日本TCI公司)。磷酸盐缓冲溶液：分别配制25 mmol·L-1Na2HPO4和25 mmol·L-1NaH2PO4溶液，将二者按一定比例混合得到pH=7.0和pH=8.0的缓冲溶液。柠檬酸-Na2HPO4缓冲溶液：分别配制100 mmol·L-1柠檬酸溶液和200 mmol·L-1Na2HPO4溶液，然后将Na2HPO4溶液逐滴加入到100 mmol·L-1的柠檬酸溶液中，调至pH=3.0。不同pH的磷酸盐缓冲溶液：分别配制15 mmol·L-1的H3PO4和Na2HPO4溶液，然后用NaOH溶液调节pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0，用NaCl调节各溶液离子强度为72 mmol·L-1。所用试剂均为分析纯。实验用水为去离子水。

1.2 实验方法

1.2.1十二烷基疏水改性季铵化纤维素的合成季铵化纤维素(QC)的合成参照文献方法[9]进行：将一定量的CHPTAC(CHPTAC与脱水葡萄糖基摩尔比为9∶1)逐滴加入到纤维素-NaOH/尿素水溶液中，搅拌反应一定时间后，用HCl中和反应液，反应液用蒸馏水透析7 d后，冷冻干燥得到QC。十二烷基疏水改性季铵化纤维素(Dodecyl Modified Quaternized Cellulose,DMQC)通过对QC进一步修饰获得：将一定量的溴代十二烷逐滴加入到含1.0wt%QC 的NaOH溶液中，在温度70 ℃ 条件下搅拌反应6 h，用HCl中和反应液，加入乙醇使DMQC沉淀，并用乙醇洗涤，冷冻干燥得到DMQC。

1.2.2临界胶束浓度测定配制6.0×10-6mol·L-1芘的丙酮溶液，取该溶液0.5 mL置于离心管中，待丙酮完全挥发后，将5 mL不同浓度的DMQC水溶液加入上述含芘的离心管中。将这些溶液在室温下平衡24 h后，使用荧光光度计测量荧光光谱(激发波长为337 nm)，以芘发射光谱中384 nm处的峰强度对DMQC的浓度作图。临界胶束浓度(CMC值)定义为荧光强度发生突变时所对应的的聚合物浓度。

1.2.3电渗流测定熔融石英毛细管(河北永年光纤厂)内径75 μm，外径365 μm，总长度为40 cm(有效长度30 cm)。测定电渗流(EOF)时，使用含DMQC的背景电解质冲洗毛细管5 min，然后在+12 kV或者-12 kV电压下预电泳5 min，将0.1 mg·mL-1的硫脲溶液在0.5 psi压力下进样3 s，在 +12 kV或者-12 kV电压下进行分离，柱温25 ℃。

1.2.4电泳分离条件电泳分离时所用毛细管及进样条件与测定电渗流时相同，电压为-12 kV。针对不同分离对象时采用不同的缓冲溶液及DMQC浓度。每次电泳分离后，毛细管分别用1.0 mol/L NaOH溶液及去离子水在20 psi压力下冲洗5 min,然后用背景电解质溶液平衡3 min。除特别说明外，检测波长为210 nm，柱温为25 ℃。

2 结果与讨论

图1 季铵化纤维素及十二烷基修饰季铵纤维素的1H NMR谱图Fig.1 1H NMR spectra of QC and DMQC samples in D2O

2.1 DMQC的合成和表征

十二烷基改性季铵化纤维素的合成主要包括两个步骤：首先，CHPTAC在碱性条件下与纤维素分子链中脱水葡萄糖基上的羟基反应，生成季铵化纤维素；然后，溴代十二烷与脱水葡萄糖基中残留羟基反应，在纤维素长链上引入十二烷基得到DMQC。依据QC和DMQC的氮含量可以计算季铵基团的取代度：DSQ=(162×NQC%)/(14-151.5×NQC%)[9,10]；十二烷基取代度：DSD=(14×DSQ÷NDMQC%-218.1)/169.3。所制备季铵化纤维素的季铵基团取代度为0.37，DMQC的疏水取代度为0.62。

图2 十二烷基修饰季铵纤维素的临界胶束浓度Fig.2 Critical micelle concentration (CMC) value of DMQC in H2O at 25 ℃

图1是QC和DMQC的1H NMR谱图。谱图中4.77 ppm的宽峰是D2O的共振信号峰，季铵基团中的甲基质子((CH3)3N+)的化学位移在3.16 ppm，其它质子的共振信号峰位于3.27～4.36 ppm之间，与脱水葡萄糖基的质子信号峰重叠。在DMQC的1H NMR图谱中，可观察到十二烷基(-O-CH2-(CH2)10-CH3)中十个亚甲基质子的化学位移在1.24 ppm处，烷烃链上甲基质子化学位移在0.84 ppm处。烷烃链中与纤维素相连的亚甲基质子(-O-CH2-(CH2)10-CH3)的共振信号与脱水葡萄糖基的质子信号峰重叠。

DMQC是含有亲水及疏水基团的两亲性分子。在水溶液中，部分两亲性聚合物能通过自组装形成以疏水基团为核，亲水链在外的球形核-壳胶束结构[11]。与传统表面活性剂类似，两亲性聚合物只有在浓度超过其CMC值时才会自组装形成胶束结构，当胶束浓度低于其临界胶束浓度时，聚合物以自由分子链的形式存在于水溶液中，因此CMC是两亲性聚合物表征的一个重要参数[12]。经检测，DMQC的CMC值约为1 000 μg·mL-1(图2)。

2.2 电渗流

DMQC分子中含有季铵基团可与毛细管内壁产生静电相互作用，改变毛细管内壁的表面电荷性质，从而引起EOF发生改变。纤维素分子链上疏水基团的引入会改变其吸附性能，进一步影响EOF。实验测定了在背景电解质中添加0～1 000 μg·mL-1的DMQC后所产生的EOF，结果如图3所示。由图3a可以看出，随着DMQC浓度的增大，阴极电渗流(正向电渗流)被抑制，电渗淌度急剧下降。当其浓度约为3 μg·mL-1时，EOF发生反向，成为阳极电渗流(反向电渗流)。随着DMQC浓度的增大，阳极电渗流逐渐增大，当浓度达到200 μg·mL-1时，阳极电渗流趋于稳定。将DMQC浓度固定为300 μg·mL-1，考察了背景电解质pH值对EOF的影响，结果如图3b，在pH=3.0～12.0范围内，均能产生阳极EOF。由于纤维素衍生物具有较好的酸碱稳定性，并且季铵基团带有正电荷，所以DMQC添加在背景电解质中能在一个较宽的pH范围内提供阳极EOF，有利于应用于不同对象的分离。

图3 DMQC浓度(a)及背景电解质pH(b)对电渗流的影响Fig.3 Effect of concentration of DMQC(a) and pH(b) on the EOF conditions:phosphate buffer,25 mmol·L-1 at pH=7.0 for(a) or 15 mmol·L-1 at pH=3.0-12.0 with constant ionic strength for(b);DMQC concentration for(b),200 μg·mL-1.each EOF value was from three measurements.

2.3 DMQC在CE中的应用

图4 DMQC用于芳香酸的分离Fig.4 The separation of aromatic acids using DMQC added in the background electrolyte 100 mmol·L-1 phosphate-citrate buffer，pH=3.0;DMQC concentration:200 μg·mL-1.peak identification:(1)salicylic acid(pKa=2.97),(2)p-aminobenzosulfonic acid(pKa=3.24),(3)p-nitrobenzoic acid(pKa=3.44),and(4)acetylsalicylic acid(pKa=3.4).

2.3.1分离芳香酸类物质采用裸露毛细管区带电泳分离具有较低pKa值的芳香酸类化合物往往较为困难，因为在低pH条件下毛细管的电渗流淌度很小，而在高pH条件下又不能利用分析对象pKa值的差异。以水杨酸、对氨基苯磺酸、对硝基苯甲酸和乙酰水杨酸(pKa值分别为2.98、3.24、3.44、3.4)为例，在裸露毛细管中进行分离时，1 h未出峰。在背景电解质中添加DMQC后，四种芳香酸在8 min以内就实现了基线分离，见图4。根据被分析物pKa值推测在pH=3.0时出峰顺序依次应该为水杨酸、对氨基苯磺酸、乙酰水杨酸和对硝基苯甲酸。但是实验结果发现，对硝基苯甲酸和乙酰水杨酸的出峰次序与预计的相反，可能源于DMQC与乙酰水杨酸之间的疏水相互作用。

2.3.2分离磺胺类药物Ng等[13,14]首次采用毛细管区带电泳研究了磺胺类药物的分离，在研究中发现很难仅靠调节pH值实现磺胺类药物的有效分离，而通过在缓冲溶液中添加β-CD，利用β-CD与苯胺基的作用可实现对磺胺类物质的分离。也有报道在pH=2.1的极端条件可对磺胺类物质实现电泳分离，此时磺胺类物质均带正电荷，但分离所需时间长[15]。图5是采用DMQC作为背景电解质添加物分离磺胺类药物的电泳图，在pH=7.5条件下，6种磺胺类药物10 min以内得到分离。

2.3.3分离中性物质DMQC分子中含有疏水基团，可能与分析对象发生相互作用，为此考察了其对中性分子的分离效果。以烷基苯酮同系物苯乙酮、苯丙酮、苯丁酮、苯戊酮和苯己酮为分离对象，丙酮作为参照物进行电泳分离，其结果如图6所示。可以看出，丙酮、苯乙酮、苯丙酮共迁移，但是随着烷基链长的增加，分析对象疏水性进一步增强，苯丁酮、苯戊酮以及苯己酮的迁移时间逐渐变长。增加DMQC的浓度至其CMC值以上，分离效果没有改善。尽管对这些中性分子只是实现了有限分离，但证明了添加DMQC除了改变电渗流的大小和方向外，还可以发挥类似胶束电动色谱中胶束的作用，可以用于一些中性物质的电泳分离。

图5 DMQC用于磺胺类药物的分离Fig.5 The separation of sulfa drugs using DMQC added in the background electrolyte 25 mmol·L-1 phosphate buffer,pH=7.5;DMQC concentration:200 μg·mL-1.peak identification:(1)sulfamethoxazole(pKa=5.6),(2)sulfadiazine(pKa=6.5),(3)sulfamerazine(pKa=7.1),(4)sulfamethazine(pKa=7.4),(5)sulfapyridine(pKa=8.4),and(6)sulfanilamide,pKa=10.4).

图6 DMQC用于中性化合物的分离Fig.6 The separation of neutral compounds 25 mmol·L-1 phosphate buffer,pH=7.0;DMQC concentration:500 μg·mL-1.peak identification:t0 acetone,(1)acetophenone,(2)propiophenone,(3)butyrophenone,(4)valerophenone,and(5)hexanophenone.

3 结论

本文合成了新型纤维素衍生物十二烷基疏水改性季铵化纤维素，将其用作毛细管电泳背景电解质的添加物，实验结果表明可以在较宽的pH范围(pH=3.0～12.0)内产生稳定的阳极电渗流，可以应用于芳香酸和磺胺类药物的快速分离，对中性化合物烷基苯同系物也有一定的分离作用。十二烷基疏水改性季铵化纤维素的加入不但可以调节电渗流的大小和方向，而且可以和分离对象发生疏水相互作用，用于不同荷电性质化合物的毛细管电泳分离。