响应面试验优化桑葚汁复合酶解制备工艺及微滤技术对其品质的影响

吕春玲，张 英，姜绍通，*

（1.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽省农产品精深加工重点实验室，安徽 合肥 230009；2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 农业部农产品质量安全重点实验室，北京 100081）

响应面试验优化桑葚汁复合酶解制备工艺及微滤技术对其品质的影响

吕春玲1，张 英2，姜绍通1，*

（1.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽省农产品精深加工重点实验室，安徽 合肥 230009；2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 农业部农产品质量安全重点实验室，北京 100081）

以新鲜成熟桑葚果实为原料，桑葚出汁率为指标，通过单因素试验及响应面试验，确定果胶酶和纤维素酶酶解制备桑葚汁的最佳工艺参数，并进一步考察非热力杀菌微滤技术对桑葚汁杀菌、澄清、褐变抑制效果以及理化指标的影响。研究结果表明，适于实际生产的最佳酶解工艺为：果胶酶添加量0.42%、纤维素酶添加量1.84%、酶解时间101.26 min、酶解温度50 ℃、酶解pH 3.5～4.0（桑葚汁自然pH值）。在此条件下，桑葚出汁率为86.37%，与理论值88.10%接近。实验表明微滤技术对桑葚汁不仅有很好的抑菌效果，且对桑葚汁的褐变具有一定的抑制作用。

酶解；桑葚汁；微滤膜；响应面法；澄清

桑果是桑树种植的副产物，属于亚热带水果，具有甜润可口、果汁丰富的特点［1-3］。桑葚不仅含有丰富的矿物质、维生素、氨基酸、花青素、白藜芦醇等生物活性成分，还含有微量元素硒，在食品行业中具有较大的发展潜力［4-6］。以桑葚为原材料经酶解工艺制备桑葚汁，为桑葚开发新产品提供更大的空间。酶解技术具有分解果肉细胞物质的能力，常用的酶主要有果胶酶、纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等，这些酶被加入到植物产品中，与植物的细胞壁发生一系列的理化反应，使细胞中的大分子物质得到分解，很大程度提高果汁的出汁率以及可溶性固形物含量［7］。

近年来，现代膜分离技术因其高效、节能等优势，在果汁的澄清和杀菌中已有研究和应用［8-9］。微滤技术是利用筛分原理，分离粒子大小为0.05～10 μm以上的膜分离技术，其主要除去液体中的大分子杂质，最终达到澄清果汁和除菌的目的。本研究采用微滤技术处理酶解后的桑葚汁，对桑葚汁微滤前后各指标进行对比分析可知，无机陶瓷微滤膜对桑葚汁不仅有很好的澄清以及除菌效果，还有一定的抗褐变作用。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

新鲜桑葚（紫黑色） 山东莱阳海特尔食品有限公司。

纤维素酶（酶活力2 000 U/g）、果胶酶（酶活力30 000 U/g）、氯化钾、浓盐酸、醋酸钠、没食子酸标品、碳酸钠、福林酚、草酸 国药集团化学试剂有限公司；微生物培养基与试剂（高盐察氏培养基、营养琼脂、孟加拉红琼脂） 北京北化康泰临床试剂有限公司。

1.2仪器与设备

HH-4 数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司；TC-PIIG型全自动色差计 北京光学仪器厂；752N紫外-可见分光光度计、AL104型精密分析天平 上海精密科学仪器有限公司；LDZ5-2型台式低速离心机 上海安亭科学仪器厂；HI850R台式高速冷冻离心机 湖南湘仪实验仪器开发有限公司；自制的加压微滤装置，可以换装过滤膜管。

1.3方法

1.3.1理化指标的测定

1.3.1.1出汁率的计算［10］

1.3.1.2褐变度的测定

准确称量桑葚汁1 mL于10 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释之后立即用紫外分光光度计定量测定桑葚汁在420 nm波长处的吸光度（A420nm）。平行测定3 次，其平均值越大说明褐变度越大［11-12］。

1.3.1.3花青素含量测定

总单体花青素含量的测定使用pH值示差法。花青素的质量浓度以矢车菊素-3-葡萄糖苷为毫克当量［13-16］。计算如式（2）所示：

式中：M为桑葚中花青素含量/（mg/L）；A为pH 1.0时520 nm与700 nm波长处吸光度差值减去pH 4.5时520 nm与700 nm波长处吸光度差值；DF为稀释倍数；Mr为矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量；ε为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数（26 900）。

1.3.1.4VC含量的测定

采用碘量法测定VC含量［17］。

1.3.1.5可溶性固形物含量的测定

采用阿贝折射仪直接测定。

1.3.1.6澄清度的测定

使用紫外-可见分光光度计，以去离子水作为参比液，在720 nm波长条件下测定桑葚汁透光率，其数值越大澄清度越高。

1.3.1.7还原糖含量的测定

采用碱性酒石酸铜的直接滴定法［18-19］。

1.3.1.8微生物的检测

根据GB 4789—2010《食品微生物学检验》测定处理和对照（未处理）桑葚汁样品中的菌落总数、霉菌和酵母菌菌群数量。

1.3.2工艺流程

1.3.3桑葚汁酶解条件优化

1.3.3.1果胶酶酶解的单因素试验

按照1.3.2节工艺，于酶解时向桑葚果浆中加入果胶酶，果胶酶水解单因素试验的3 组变量以及数据分别为：酶解温度30～70 ℃、加酶量0.1%～0.5%（占桑葚果肉质量的百分比）、酶解时间0～120 min。同时，通过查阅相关文献和预实验最终确定果胶酶酶解的最适pH 3.5，故可将桑葚汁的自然pH值（3.5～4.0）作为酶解的固定参数，根据酶解各参数的范围进行试验，测定桑葚汁的出汁率，以确定最适参数范围。

1.3.3.2纤维素酶酶解的单因素试验

照1.3.2节工艺，于酶解时向桑葚果浆中加入纤维素酶，纤维素酶水解单因素试验的3 组变量以及数据分别为：酶解温度30～70 ℃、加酶量1.2%～2.0%（占桑葚果肉质量的百分比）、酶解时间0～120 min，由预实验和相关文献可知纤维素酶的最适pH 4.0，故可将桑葚汁的自然pH值（3.5～4.0）设定为酶解的固定参数，根据酶解各参数的范围进行试验，测定桑葚汁的出汁率，以确定最适参数范围。

1.3.3.3桑葚汁复合酶酶解条件优化

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken模型，在桑葚汁的自然pH值条件下，酶解温度为50 ℃，选取果胶酶添加量、纤维素酶添加量、复合酶解时间为自变量，并以1、0、-1 分别代表自变量的高、中、低3 个不同水平，见表1。

表1　Box-Behnken试验因素及水平Table 1 Coded levels for factors used in Box-Behnken design

1.3.4微滤处理滤孔孔径的选择及其对桑葚汁品质的影响［20-22］

采用3 种孔径（0.5、0.2、0.05 μm）的氧化铝微滤膜对桑葚汁进行过滤处理，以澄清度、微生物的数量等为指标，考察微滤处理对桑葚汁的澄清效果和非热力杀菌效果的影响，以及微滤处理后桑葚汁理化指标的变化。

实验中无机陶瓷膜微滤的条件为操作压力0.25 MPa、操作温度25 ℃、滤液流速控制在2 m/s，在此条件下对桑葚汁进行微滤处理，桑葚汁的循环量为10 L，微滤时间90 min。

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1果胶酶添加量对桑葚出汁率的影响

为了考察果胶酶添加量对桑葚汁出汁率的影响，取20 mL鲜榨桑葚汁，加入质量分数为0.1%～0.5%的果胶酶，在酶解水浴温度为50 ℃条件下水解90 min，结果见图1。

图1　果胶酶添加量对桑葚出汁率的影响Fig.1 Infl uence of pectinase dosage on mulberry juice yield

由图1可以看出，桑葚汁的出汁率受果胶酶添加量影响较大，当果胶酶添加量达到0.3%～0.5%时桑葚的出汁率较高。同时，在果胶酶添加量为0.4%的条件下，桑葚的出汁率达到最高值79%，综上果胶酶酶解桑葚汁的最适添加量范围为0.3%～0.5%。

2.1.2果胶酶酶解时间对桑葚出汁率的影响

为了考察果胶酶酶解时间对桑葚汁出汁率的影响，取20 mL鲜榨桑葚汁，加入0.4%的果胶酶，在酶解水浴温度50 ℃条件下水解不同的时间，结果见图2。

图2　果胶酶酶解时间对桑葚出汁率的影响Fig.2 Infl uence of pectinase hydrolysis time on mulberry juice yield

由图2可知，酶解时间在0～120 min范围内，随着时间的延长，桑葚的出汁率先上升后逐渐趋于稳定，在酶解时间为90 min时，桑葚的出汁率达到78%，之后随酶解时间的延长，桑葚汁的稳定性有所下降。因此，果胶酶酶解桑葚汁的最适时间范围初定为60～120 min。

2.1.3果胶酶酶解温度对桑葚出汁率的影响

为了考察果胶酶酶解温度对桑葚汁出汁率的影响，取20 mL鲜榨桑葚汁，加入0.4%的果胶酶，在不同的水浴温度条件下水解90 min，结果见图3。

图3　果胶酶酶解温度对桑葚出汁率的影响Fig.3 Infl uence of pectinase hydrolysis temperature on mulberry juice yield

由图3可知，桑葚出汁率随着酶解温度的上升呈先增加后降低的趋势，在酶解温度达到50 ℃的时候，桑葚的出汁率达到最大值。综上果胶酶酶解的最适温度为50 ℃。

2.1.4纤维素酶酶解温度对桑葚出汁率的影响

图4　纤维素酶酶解温度对桑葚出汁率的影响Fig.4 Infl uence of cellulase hydrolysis temperature on mulberry juice yield

为了考察纤维素酶酶解温度对桑葚汁出汁率的影响，取20 mL鲜榨桑葚汁，加入1.8%的纤维素酶，在不同的水浴温度条件下水解90 min，结果见图4。

由图4可知，桑葚的出汁率随着纤维素酶酶解温度的上升先上升后下降，当纤维素酶酶解温度达到50 ℃时，桑葚出汁率达到最大值，纤维素和果胶等物质形成的大分子结合体系因受到酶解的作用，复合体系被破坏使桑葚汁的浊度受到影响，综上纤维素酶酶解的最适温度为50 ℃。

2.1.5纤维素酶解时间对桑葚出汁率的影响

为了考察纤维素酶酶解时间对桑葚汁出汁率的影响，取20 mL鲜榨桑葚汁，加入1.8%的纤维素酶，在酶解水浴温度50 ℃条件下水解不同的时间，结果见图5。

图5　纤维素酶酶解时间对桑葚出汁率的影响Fig.5 Infl uence of cellulase hydrolysis time on mulberry juice yield

图6　纤维素酶添加量对桑葚出汁率的影响Fig.6 Infl uence of cellulase dosage on mulberry juice yield

由图6可知，桑葚出汁率随纤维素酶添加量的增加先逐渐上升，然后趋于稳定，当纤维素酶添加量大于1.8%后，能被水解的底物不断减少，因此，桑葚的出汁率不再提高；从生产桑葚汁的稳定性和经济方面考虑，纤维素酶添加量的最适范围为1.6%～2.0%。

2.2响应面试验结果

用Box-Behnken对桑葚酶解条件设计三因素三水平的响应面分析试验，再用Design-Expert 8.0.5软件对响应面试验结果（表2）进行回归分析。2.2.1 模型及显著性检验

表2　Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Box-Behnken design with experimental results of juice yield

以桑葚出汁率为响应值，经多元回归拟合，可得到桑葚出汁率对果胶酶添加量、纤维素酶添加量及复合酶解时间的二次多项式回归方程。利用Design-Expert软件进行二次多项式拟合（非线性），可以得到一个预测二次多项式：

表3　回归方程显著性检验Table 3 Signififi cance test for regression equation

如表3所示，根据回归方差分析显著性检验，该模型为回归显著型，即P＜0.000 1，且失拟项不显著，即P值为0.366 3。该模型R2=0.977 0，=0.947 4，说明该模型与试验有很好的拟合性；其中一次项X1、X2、X3的影响极显著（P＜0.01）；二次项X12、X32的影响极显著（P＜0.01），X22的影响显著（P＜0.05）；此外由等高线以及对应的响应面图可知果胶酶添加量与纤维素酶添加量（X1X2）、果胶酶添加量与复合酶解时间（X1X3）两者之间的交互作用对桑葚出汁率的影响，如图7所示，X1X2、X1X3交互作用极显著（P＜0.01），X2X3的交互作用不显著（P＞0.05）；自变量与响应值之间的线性关系显著（P＜0.000 1），所以此模型可以用于桑葚酶解工艺试验的预测［23］。

图7　因素交互作用对桑葚出汁率影响的响应面及等高线图Fig.7 Response surface and contour plots showing the interactive effects of hydrolysis parameters on juice yield

由表3可知，纤维素酶添加量和复合酶解时间的交互作用不显著（P＞0.05），将不显著因子X2X3剔除后，得到新的二次回归方程如下：

2.2.2响应面模型验证

为验证响应面法获得结果的可信度，根据优化桑葚复合酶解工艺条件（果胶酶添加量0.42%、纤维素酶添加量1.84%、复合酶解时间101.26 min）及复合酶解温度（50 ℃）、pH值（果汁的自然pH值）进行验证实验，重复3次，测得桑葚的出汁率为86.37%，所得实际值与理论值88.10%的相对误差为1.96%，说明经响应面法优化后获得的桑葚复合酶解工艺参数是可信的。

2.3无机陶瓷微滤膜对桑葚汁理化指标以及微生物指标的影响

检测了3 种孔径陶瓷微滤膜对桑葚汁的理化成分和微生物指标的影响，如表4所示。

表4　3 种孔径的陶瓷微滤膜对桑葚汁理化等指标的影响Table 4 Effect of three kinds of ceramic microfifi ltration membranes on physical and chemical indicators of mulberry juice

由表4可知，可溶性固形物的含量受3 种无机陶瓷微滤膜处理的影响较小，没有经过微滤膜处理的对照样的可溶性固形物含量9.8°Brix；然而经过3种孔径分别为0.5、0.2 μm和0.05 μm的膜澄清后的桑葚汁可溶性固形物含量分别为9.6、9.3、8.9°Brix；0.5、0.2、0.05 μm的微滤膜处理后得到澄清汁常温放置1 d后的褐变度分别为0.713、0.615和0.538，由此可知无机陶瓷微滤可以很好地抑制桑葚汁的褐变；微滤前后桑葚汁中花青素的含量有一定的变化，0.5、0.2、0.05 μm的微滤膜处理后的桑葚汁花青素含量损失分别为15.6%、16.5%和18.7%。微滤膜的孔径比桑葚汁中花青素分子要小，所以部分大分子花青素被滤膜吸附，除了截留花青素大分子之外还有可能减少桑葚中的其他活性物质［24］，比如VC也有一定的损失率；无机陶瓷膜微滤对桑葚汁中还原糖的含量影响不是很大，0.5、0.2、0.05 μm的微滤膜微滤澄的桑葚清汁的还原糖损失率分别为1.3%、4.0%和5.4% ，说明无机陶瓷微滤膜对桑葚汁中还原糖的截留作用不大；0.5、0.2 μm和0.05 μm的微滤膜对桑葚汁的处理，很大程度上提高了桑葚汁的澄清度，其中0.2 μm和0.05 μm微滤膜的澄清效果优于0.5 μm的微滤膜。

3 种孔径的无机陶瓷微滤膜不仅对桑葚汁的澄清效果很好，还有很好的抑菌效果。从表4菌落总数以及霉菌和酵母菌的去除效果可以看出，由于0.5 μm膜孔径较大，除菌效果不明显，经0.5 μm膜微滤后的桑葚汁，菌落总数剩余4.5×102CFU/mL，霉菌及酵母菌剩余1.2×102CFU/mL，国家规定果汁中细菌总数小于100 CFU/mL，霉菌及酵母菌小于20 CFU/mL，由此可知该处理并未达到国家标准规定；然而0.2 μm的微滤膜却能比较好地减少菌落总数以及霉菌和酵母菌的数量，并达到国家标准规定的要求；0.05 μm微滤膜的除菌效果在三者之中最好，菌落总数、霉菌及酵母菌的指标都可达到国家标准规定的要求。由此可见，无机陶瓷膜微滤可以作为桑葚汁的一种冷杀菌工艺，相对于传统的热杀菌工艺，冷杀菌工艺可以很好的保持桑葚汁中的营养物质［25］。

综合桑葚汁的澄清度、活性物质的保存率和菌落总数等指标可以看出，通过0.2 μm膜澄清桑葚汁的综和指标最好。

3　结 论

在桑葚汁中加入复合酶进行酶解，通过响应面优化试验并结合实际生产需求，得到适于实际生产的最佳工艺参数为：果胶酶添加量0.42%、纤维素酶添加量1.84%、复合酶解时间101.26 min、复合酶解温度50 ℃、酶解pH 3.5～4.0（桑葚汁自然pH值）。该工艺参数条件下桑葚出汁率为86.37%，与 理论值的相 对误差为1.96%，这表明此回归模型能够很好地预测桑葚的出汁率，并且优化的效果较为明显。

3 种孔径无机陶瓷膜微滤对桑葚汁的可溶性固形物含量、还原糖含量、花青素含量和VC含量影响不大；0.05 μm和0.2 μm膜的澄清以及抑菌效果好于0.5 μm的膜；除此之外，微滤处理还有很好的抑制褐变的作用。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis Conditions for the Production of Mulberry Juice by Response Surface Methodology and Infl uence of Microfi ltration on the Quality of Mulberry Juice

LÜ Chunling1， ZHANG Ying2， JIANG Shaotong1，*
（1. Key Laboratory for Agriculture Processing of Anhui Province， School of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology， Hefei 230009， China； 2. Key Laboratory of Agri-food Safety and Quality， Ministry of Agriculture，Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agri-products， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China）

In this study， the enzymatic hydrolysis of ripen fresh mulberries with pectinase and cellulase individually and in combination was optimized using combination of one-factor-at-a-time method and response surface methodology to obtain maximum juice yield. Further investigations were carried out to examine the infl uence of microfi ltration as a non-thermal sterilization technology on microbial load， clarity， browning and physicochemical properties of the mulberry juice. A mixture of pectinase and cellulase was the most effi cient enzyme for actual production of mulberry juice and the optimal hydrolysis parameters were determined as follows： pectinase concentration， 0.42%； cellulase concentration， 1.84%； hydrolysis time，101.26 min； hydrolysis temperature， 50 ℃； and pH， 3.5-4 （the natural pH of mulberry juice）. Experiments conducted under the optimized conditions led to a mulberry juice yield of 86.37%， agreeing with the predicted value （88.10%）. Our study also demonstrated that microfiltration could not only reduce the microbial load of mulberry juice but also be effective against its browning.

enzymatic hydrolysis； mulberry juice； microfi ltration； response surface methodology； clarifi cation

TS202.3

A

1002-6630（2015）18-0041-06

10.7506/spkx1002-6630-201518007

2015-01-02

“十一五”国家科技支撑计划项目（2010BAD01B07）；安徽省自然科学基金项目（1408085MC67）

吕春玲（1991—），女，硕士研究生，研究方向为农产品加工与贮藏。E-mail：lvchunling09118013@163.com

姜绍通（1954—），男，教授，硕士，研究方向为大宗食品加工与生物质发酵工程。E-mail：jstxsgj@163.com