响应面试验优化超声波辅助合成地奥司明工艺

黎海涛，王鲁峰，潘思轶*

（华中农业大学食品科学技术学院，环境食品学教育部重点实验室，湖北 武汉 430070）

响应面试验优化超声波辅助合成地奥司明工艺

黎海涛，王鲁峰，潘思轶*

（华中农业大学食品科学技术学院，环境食品学教育部重点实验室，湖北 武汉 430070）

以橙皮苷为原料，采用超声波技术，探究地奥司明新型合成路线。在单因素试验基础上，选取超声功率、超声时间、反应时间、反应温度为影响因素，地奥司明得率为响应值，利用Box-Behnken设计原理和响应面试验分析法，研究各因素及其相互作用对得率的影响，模拟得到二次多项式回归方程的预测模型，确定最佳反应条件为：超声功率700 W、超声时间25 min、反应时间5.6 h、反应温度120 ℃。在此条件下，地奥司明合成的得率为21.35%，与理论预测值得率21.78%相比，其相对误差为1.97%，并通过多种波谱方式验证了合成物为目标产物地奥司明。说明通过响应面优化后得到的回归方程具有一定的实践指导意义，同时本实验也为地奥司明的超声波辅助合成提供一定的思路。

地奥司明；合成；超声波；响应面分析

地奥司明又名香叶木苷，是一种天然的黄酮类化合物。地奥司明具有改善静脉张力、增强淋巴回流、保护毛细血管微循环、阻断炎症反应和降低毛细血管通透性的作用［1-2］；地奥司明对慢性静脉功能不全有明显的治疗作用；大规模的临床试验已经证明地奥司明能够控制急性或者慢性痔疮症状［3-4］；联合物理治疗，能够有效改善腰椎间盘突出症［5］。近年研究表明，其在抗肿瘤、治疗糖尿病、抗炎等方面也表现出很好的活性［6-8］。

由于天然植物中地奥司明含量非常低，无法满足医疗的大量需求，所以现在药用的地奥司明都是以橙皮苷为原料经过化学合成而来的。章思规等［9］以吡啶为溶剂，以碘为氧化剂，工艺过程简单，得率超过90%，但纯度不详；杨爱玲［10］合成的地奥司明得率约56%，但要用到醋酐、吡啶、溴气、二氯甲烷等，试剂较多，操作复杂，废弃物多；冯宣等［11］的合成中用氢氧化钠和碳酸钾等强碱性物质替代了吡啶，减少了有毒试剂的危害，但需要经过多步反应，收率为70%，纯度不详；骆萌［12］采用了溴和碘2 种方式脱氢，碘脱氢得率69%、纯度99%，溴脱氢得率58%、含量89%。根据专利文献查找到的方法，目前多以吡啶、醋酐、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等有毒有害的有机试剂为溶剂，对人体和环境都造成极大的危害。近年来超声波技术在食品添加剂合成、微生物代谢、酒类发酵、食品检测、控制结晶等方面有了许多新的应用［13-16］，且由于超声波在液体媒介中的空化机制［17］能加快粒子的运动速率，破坏粒子力的形成，从而使许多物理化学和化学过程急剧加速，所以本实验拟采用超声波技术，并以碳酸钠溶液为溶剂，通过响应面法来探究一条地奥司明的超声波辅助合成工艺。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

橙皮苷 西安开来生物工程有限公司；碳酸钠、氢氧化钠、盐酸、无水乙醇（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；甲醇、乙腈、冰醋酸（均为色谱纯）赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.2仪器与设备

1100VL液相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦科技有限公司；e2695高效液相色谱仪 美国Waters公司；UV-1800紫外-可见光分光光度计 日本岛津公司；Bruker 400MHz固体核磁仪 德国布鲁克公司；JY92-2D超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；HH-WD反应釜 上海一凯仪器设备有限公司。

1.3方法

1.3.1合成地奥司明的工艺流程

图1　合成地奥司明的反应方程式Fig.1 Reaction mechanism for synthesizing diosmin

参考冯宣等［11］地奥司明的合成方法，选取无机碱溶液作为反应溶剂，但采用超声波技术简化反应过程。合成路线如图1所示，准确称取经过超微粉碎的橙皮苷10 g，与20 g无水碳酸钠混合，一起溶解在150 mL蒸馏水中，然后置于超声波细胞粉碎机下进行超声，形成溶液a；同时，将碘化钠2 g与碘6 g溶解在150 mL无水乙醇中，形成溶液b；将溶液b倒入反应釜中加热，调节反应温度；待溶液a超声完毕，迅速倒入反应釜中与溶液b混合，一起加热反应，反应完毕加入3.75 mol/L氢氧化钠乙醇溶液40 mL，保持70 ℃继续反应1 h后停止加热，用3.75 mol/L盐酸调节溶液pH 5，析出土黄色沉淀，抽滤，洗涤，得到地奥司明粗品。

1.3.2合成工艺单因素试验

1.3.2.1超声功率对地奥司明合成的影响

固定反应过程的超声时间20 min、反应时间5.5 h、反应温度130 ℃，分别考察了400、480、560、640、720、800 W 6 个超声功率条件下的合成过程，测定不同产物的得率和纯度，确定最优的超声功率。

1.3.2.2超声时间对地奥司明合成的影响

固定反应过程的超声功率600 W、反应时间5.5 h、反应温度130 ℃，分别考察了10、14、18、22、26、30 min 6个超声时间条件下的合成过程，测定不同产物的得率和纯度，确定最优的超声时间。

1.3.2.3反应时间对地奥司明合成的影响

固定反应过程的超声功率600 W、超声时间20 min、反应温度130 ℃，分别考察了4、4.6、5.2、5.8、6.4、7 h 6个反应时间条件下的合成过程，测定不同产物的得率和纯度，确定最优的反应时间。

1.3.2.4反应温度对地奥司明合成的影响

固定反应过程的超声功率600 W、超声时间20 min、反应时间5.5 h，分别考察了110、118、126、134、142、150 ℃ 6个反应温度条件下的合成过程，测定不同的产物的得率和纯度，确定最优的反应温度。

1.3.3合成地奥司明工艺条件优化

按照Box-Behnken设计原理，在单因素试验基础上，以地奥司明得率和纯度作为响应值，选取超声功率、超声时间、反应时间和反应温度4 个单因素进行响应面试验，来优化地奥司明合成的工艺条件。试验设计中的因素与水平见表1。

表1　响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

1.3.4地奥司明得率和纯度的计算

式中：610为橙皮苷相对分子质量；608为地奥司明相对分子质量。

地奥司明纯度的测定：采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法［18］：色谱柱，Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm）；流动相，水-甲醇-冰醋酸-乙腈（66∶28∶6∶2，V/V）；流速，1 mL/min；检测波长：275 nm；柱温35 ℃；进样量10 μL。得到地奥司明标准曲线的回归方程y=107x-91 150（R2=0.999 4，y为地奥司明标准液浓度，x为峰面积），地奥司明的纯度为HPLC测得合成粗品中地奥司明的质量百分比。

1.3.5检测方法

按照欧洲药典药品标准EP 7.0的标准检测。

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1超声功率对地奥司明合成的影响

图2　超声功率对地奥司明合成的影响Fig.2 Infl uence of ultrasonic power on diosmin yield

从图2可以看出，随着超声功率的增加，地奥司明的合成得率呈先上升后下降的趋势，在640 W左右达到最高。这是因为对一定频率和一定发生面的超声波，功率增大，声强也随之增大。单位时间内超声产生的空化事件增多，从而有利于反应的进行，但太高声强产生的大量空泡通过反射波可能减少能力的传递，并且与声强的增加呈非线性［19］。以得率作为参考值，选取500、600、700 W继续对地奥司明的合成做响应面分析，以确定最佳的超声功率。

2.1.2超声时间对地奥司明合成的影响

图3　超声时间对地奥司明合成的影响Fig.3 Infl uence of ultrasonic irradiation time on diosmin yield

由图3可知，超声时间对地奥司明的合成有明显影响。随着超声时间的延长，地奥司明合成得率呈现不断上升的趋势，大约在18 min处得率达到一个最高点，超声时间继续延长，得率下降。超声时间太短，对橙皮苷的助溶效果不明显，溶解不充分，超声时间过长，又会引起橙皮苷结构的变化从而影响合成效果［20］。以得率作为参考值，选取15、20、25 min继续对地奥司明的合成做响应面分析，以确定最佳的超声时间。

2.1.3反应时间对地奥司明合成的影响

如图4所示，当反应时间延长时，地奥司明的得率不断上升，在反应5.6 h左右达到最大值，反应时间继续延长，得率下降，这说明在不断反应的过程中伴随着副反应的发生，且时间越长，副反应越多，杂质越多［21］。以得率作为参考值，决定选取反应时间4.5、5.5、6.5 h继续对地奥司明的合成做响应面分析以确定最佳反应时间。

2.1.4反应温度对地奥司明合成的影响

图5　反应温度对地奥司明合成的影响Fig.5 Infl uence of reaction temperature on diosmin yield

如图5所示，随着反应温度的升高，地奥司明合成的得率呈现出先增加后下降的趋势，下降趋势较大，在128 ℃处达到最大值。温度升高，分子碰撞的几率增大，有利于正反应，随着温度的不断升高，溶液黏度增加，副反应增加，杂质增多，产品得率下降［22］。以得率作为参考值，选取115、125 、135 ℃ 3 个水平对地奥司明的合成继续做响应面分析以确定最佳的反应温度。

2.2响应面提取条件的优化

2.2.1响应面试验设计及结果

根据Box-Behnken试验设计原理，综合分析单因素试验，选取了超声功率（A）、超声时间（B）、反应时间（C）和反应温度（D）4 个对地奥司明合成有影响的因素，设计了四因素三水平的响应面分析试验，见表2。

表2　Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Box-Behnken design with experiment results

使用Design-Expert 8.0软件，以超声功率、超声时间、反应时间、反应温度为影响因素，以地奥司明得率为响应值对表2的数据进行处理，得到表3回归方程方差分析表，利用软件进行非线性回归的二次多项式拟合，得到预测模型如下：

如表3所示，回归方差分析显著性检验表明，此模型回归显著（P＜0.000 1），失拟项不显著。得率模型0.944 1，=0.888 1，说明模型与实际试验拟合满足要求，自变量与响应值之间线性关系显著，可以用于地奥司明合成工艺的预测。

从得率的方差分析结果可以看出，方程的一次项A、D对响应值的影响显著，交互项AB、AC、BC、BD、CD对响应值的影响显著，二次项对响应值的影响均显著。由此可见，各具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。

表3　得率回归方程方差分析表Table 3 Analysis of variance of regression model for diosmin yield

F值可以反映各试验因素对试验指标的重要性，F值越大，表明对试验指标的影响越大。从表3可见，各因素对地奥司明合成得率的的影响程度大小为：反应温度＞超声功率＞反应时间＞超声时间。

2.2.2响应面分析

根据回归方程可以得到相应的响应面图，考察所拟合的响应面曲面形状，分析超声功率、超声时间、反应时间、反应温度相互作用对地奥司明合成反应的影响。

图6　各因素交互作用对合成得率的影响Fig.6 Reponse surface graphs showing the effects of independent variables on diosmin yield

由图6可知，反应温度对地奥司明合成得率的影响极为显著，其绘制的曲线最为陡峭；超声功率对得率的影响次之，曲线较为陡峭，而影响最小的为超声时间，相较于其他因素，它的曲线较为平滑一些。通过响应面法预测得到的模型分析，在模型范围内，选择得率最大化，得到地奥司明最佳合成工艺条件为：超声功率700 W、超声时间25 min、反应时间5.65 h、反应温度120.17 ℃。预测的工艺条件下，地奥司明合成反应得率为21.78%。

2.2.3模型验证

为检验响应面法所得结果的可靠性，采用上述条件进行地奥司明合成反应，考虑到实际操作的便利，将工艺条件修正为反应时间5.6 h、反应温度120 ℃。以上述条件进行验证实验，重复3 次实际测得的反应得率平均值为21.35%。说明通过响应面优化后得出的回归方程具有一定的实践指导意义。

2.3地奥司明结构表征

根据上述反应条件进行地奥司明合成反应，将所得到的地奥司明进行结构解析，通过HPLC、电喷雾质谱（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）和核磁共振（nuclear magnetic responance，NMR）等方法，对该化合物的结构及波谱数据进行详细解析。

移取地奥司明标准对照品和合成产品进行HPLC分析，结果见图7。

图7　地奥司明标准品（A）和产品（B）的HPLC图谱Fig.7 HPLC chromatograms of diosmin standards （A） and synthetic diosmin （B）

图7A为地奥司明标准品的HPLC图谱，地奥司明保留时间为18.662 min。图7B为合成产品的HPLC图谱，结果得到了较好的分离，地奥司明保留时间为18.513 min，与标准品对应。同时，图7B的13.074 min是未完全反应的橙皮苷的保留时间。

移取地奥司明溶液进行ESI-MS分析，结果见图8。

图8　地奥司明ESI负离子一级质谱图Fig.8 ESI- MS primary spectrum of diosmin

图8中m/z 607是ESI-准分子离子峰信号，为［M—H］-峰即（608-1），较强的m/z 299碎片离子峰结构为［MC12H21O9］-，m/z 256碎片离子峰结构为［M-C12H21O9-C2H3O］-，与地奥司明应有的质谱信息一致［23］。

使用氘代二甲基亚砜溶解试样，四甲基硅烷作内标，测定地奥司明的1H NMR和13C NMR图谱，结果见图9。

图9　地奥司明样品的1H NMR（AA）和1133C NMR（BB）图谱Fig.91H NMR and13C NMR spectra of diosmin

对地奥司明样品的NMR图谱进行分析，并参照李文杰等［23］对地奥司明的波谱特征的分析，认为地奥司明符合预定化学结构。

综上所述，本工作利用HPLC、MS和NMR技术对合成的样品结构进行了验证，证明合成所得物正是我们的目标产物地奥司明。

3　结 论

本实验采用超声波辅助的方法合成地奥司明，通过单因素试验和Box-Behnken设计原理以及响应面分析法对合成工艺进行优化，拟合了超声功率、超声时间、反应时间和反应温度4 个因素对地奥司明合成得率的回归模型，经检验证明该模型合理可靠，能较好地预测出地奥司明合成的得率。由该模型确定的最佳合成条件为超声功率700 W、超声时间25 min、反应时间5.6 h、反应温度120 ℃。在此条件下，合成的地奥司明得率为21.35%。

由于橙皮苷特殊的溶解性，现在最常用的是采用吡啶作为溶剂，吡啶的氮杂原子有一对未共享电子，因此具有碱性［24］。橙皮苷易溶于吡啶，在地奥司明的合成过程中不仅作为溶剂，同时与碘反应生成卤代吡啶，作为反应中间体参与反应，有利于碘代地奥司明的生成［25］。相比之前文献中提到过的地奥司明合成方法，本实验采用超声波辅助技术，加速橙皮苷在稀碱溶液中的溶解，但溶解性远逊于吡啶，且无法形成类似于卤代吡啶的中间体，所以产品得率不高。但本实验旨在探索使用无毒无害的无机溶剂联合物理方法的方式来合成地奥司明的效果，从方法上提供了一定的依据和可行性。同时也为今后地奥司明合成方法的更新提供一个方向，以此来满足无毒无害、低污染生产。

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Synthesis Process of Diosmin by Response Surface Methodology

LI Haitao， WANG Lufeng， PAN Siyi*
（Key Laboratory of Environment Correlative Dietology， Ministry of Education， College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

This study aimed to develop a new ultrasonic-assisted procedure for the synthesis of diosmin from hesperidin. Four factors including ultrasonic power， irradiation time， reaction time and reaction temperature were optimized using Box-Behnken design and response surface methodology based on single factor investigations for achieving maximum yield of diosmin. The optimization was performed by examining the infl uence of the four independent variables and their interactions on diosmin yield. A quadratic polynomial regression model equation was set up. By analyzing the response surface model， the optimum synthesis conditions were determined as follows： ultrasonic power， 700 W； irradiation time， 25 min； reaction time， 5.6 h， and reaction temperature， 120 ℃. Experiments carried out under these conditions gave a diosmin yield of 21.35%， showing a relative error of 1.97% compared to the predicted value （21.78%）. The product was identifi ed as diosmin by applying various spectroscopic methods. The presented response surface regression equation is of some practical signifi cance for optimizing the ultrasonic-assisted synthesis of diosmin.

diosmin； synthesis； ultrasound； response surface analysis

R914.5

A

1002-6630（2015）18-0047-06

10.7506/spkx1002-6630-201518008

2015-01-25

国家现代农业柑橘产业技术体系岗位科学家项目（CARS-27-05B）

黎海涛（1 989—），男，硕士研究生，研究方向为农产品加工。E-mail：356340517@qq.com

潘思轶（1964—），男，教授，博士，研究方向为植物性农产品加工。E-mail：siyipan@aliyun.com