高效液相色谱法对蓝莓果实中8 个有机酸含量的测定

徐玉涛，李珂珂，王贺新，陈丽荣，弓晓杰，*

（1.大连大学医学院，辽宁 大连 116622；2.大连大学现代化农业研究院，辽宁 大连 116622；3.大连大学环境与化学工程学院，辽宁 大连 116622）

高效液相色谱法对蓝莓果实中8 个有机酸含量的测定

徐玉涛1，李珂珂1，王贺新2，陈丽荣3，弓晓杰1，*

（1.大连大学医学院，辽宁 大连 116622；2.大连大学现代化农业研究院，辽宁 大连 116622；3.大连大学环境与化学工程学院，辽宁 大连 116622）

建立同时测定蓝莓果实中8 个有机酸类成分含量的高效液相色谱法，并利用该方法测定26 个不同品种蓝莓果实中的有机酸含量。结果表明，所测品种中塞拉的有机酸含量最高，达25.135 26 mg/g鲜果，最低的为克瑞顿，仅含2.368 31 mg/g鲜果。该方法简便、快速、准确，具有良好的重复性和回收率，可作为蓝莓果实中有机酸含量的测定方法。

蓝莓；有机酸；柠檬酸；高效液相色谱；含量测定

蓝莓，又名蓝浆果、越橘，为杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium）多年生灌木果树，其果酸、甘、平，可止痢［1］。现代研究显示，蓝莓果实中含有丰富的花色素花青素、酚酸、有机酸等多种有效成分［2-3］，具有抗肿瘤、增强记忆力、增强视力、调节血脂、延缓衰老、消炎、调节血糖、改善血液循环、减肥等功效［4-12］，因此蓝莓被国际粮农组织列为五大健康食品之一［13］。蓝莓中的花青素一直是研究的热点，但有机酸的存在不仅对蓝莓的风味有影响，更重要的是对花 色苷等物质具有保护作用。

目前对有机酸的检测方法很多［14-16］，高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）技术应用于蓝莓有机酸的含量检测也有报道［17-23］，但已有的报道选择的品种有限，同时测定有机酸的种类也不多。本实验采用HPLC法同时测定26 种蓝莓中8 个有机酸的含量，建立的方法准确可靠，简便快捷，是一种分析蓝莓有机酸类成分的有效途径，可为蓝莓中有机酸的开发利用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

蓝莓（Vaccinium uliginosum Linn）于2014年6月采自大连大学蓝莓研究所试验基地（大连市亮甲店镇），品系有北高丛蓝莓、半高丛蓝莓、矮丛蓝莓3 类，其中北高丛蓝莓有蓝丰（Bluecrop）、蓝金（Bluegold）、日出（Sunrise）、双迪（D-Ⅱ）、伯克利（Berkeley）、赫伯特（Herberd）、迪克西（Dixi）、伊丽莎白（Elizabeth）、塞拉（Sierra）、钱德勒（Chandler）、卡拉（Cara’s Choice）、艾克塔（Echota）、莱格西（Legacy）、蓝鸟（Bluejay）、布里吉塔（Brigitta）、蓝港（BlueHaven）、克瑞顿（Croaton）、爱国者（Patriot）、维口（Weymouth）、哈里森（Harrison）、柳叶（Willow）21 个品系；半高丛蓝莓有北蓝（Northblue）、北陆（Northland）、黑珍珠（Black Pearl）3 个品系；矮丛蓝莓有艾诺（Aino）、美登（Blomidon）2 个品系，总共26 个品系。

草酸、酒石酸、奎宁酸、甲酸、苹果酸、莽草酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸标准品 百灵威科技有限公司；甲醇（色谱纯） 美国Tedia公司；纯净水 杭州娃哈哈集团有限公司；盐酸、磷酸、磷酸二氢钾（分析纯） 天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

LC-1260高效液相色谱仪（G4212-60008二极管阵列检测器） 德国安捷伦科技有限公司；BS224S电子天平 赛多利斯科学仪器有限公司；SB-5200DTD超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；EYELA N-1100旋转蒸发仪 东京理化器械株式会社上海爱朗仪器有限公司；DLSB-5/20低温冷却液循环泵 郑州长城科工贸有限公司；隔膜真空泵 天津市津腾实验设备有限公司。

1.3方法

1.3.1标准溶液的制备

分别精密称取草酸、酒石酸、奎宁酸、甲酸、苹果酸、莽草酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸对照品，用纯净水根据标准品在HPLC中的响应值大小配制成8～20 mg/mL不同质量浓度的标准品储备液，再稀释制备成不同质量浓度的对照品溶液。

1.3.2样品溶液的制备

考察了蓝莓果实中有机酸提取时所用溶剂水、甲醇、乙醇及其pH值在1、2和3时对提取效果的影响，同时还考察了料液比的影响，分别以1∶5、1∶10和1∶15各进行3 次实验。将所得的提取液通过HPLC分析，根据有机酸峰面积的大小，发现有机溶剂提取的峰面积小于水提取，而3个pH值条件下根据峰面积大小提取物量基本一样；料液比1∶5时峰面积小于料液比1∶10和1∶15，料液比1∶10和1∶15基本无差别。因此最终选择以水为溶剂并用盐酸调pH值为1，按1∶10的料液比进行提取时效果最好［24-25］。

最终确定的样品溶液制备方法为：精密称取5.0 g蓝莓鲜果，切碎，以1∶10料液比加入含0.2%盐酸的纯净水，超声提取30 min，过滤，滤渣以上述方法再提取一次，合并滤液，浓缩，定容，待HPLC定量分析。

1.3.3色谱条件

分别考察了流动相为磷酸二氢钾、磷酸二氢铵及其浓度分别在0.01、0.02、0.03 mol/L时的分离效果，考虑到检测成分均为酸性物质，根据样品中各有机酸化合物的分离度，最后选择0.01 mol/L的磷酸二氢钾溶液为流动相。此外，在此流动相的分离条件下，流速对各个有机酸的分离度也有重要影响，为了使所测定有机酸化合物达到基线分离，尤其是草酸与其前面未知物、酒石酸与奎宁酸的分离，在1.0 mL/min流速时，这些物质均未达到基线分离，影响定量结果准确性，最终选择流速为0.8 mL/min。

最终确定的色谱条件为：色谱柱Xtimate XB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为0.01 mol/L的磷酸二氢钾溶液（磷酸调节pH 2.5）；G4212-60008二极管阵列检测器，检测波长215 nm；流速0.8 mL/min；柱温40 ℃；进样量10 μL［26-28］。

2　结果与分析

2.1有机酸标准曲线的建立

分别吸取不同质量浓度的有机酸对照品10 μL进样。以有机酸对照品质量浓度X对峰面积Y进行线性回归，得到标准曲线，按信噪比3∶1确定检测限，见表1。

表1　8 种有机酸对照品标准曲线方程Table 1 Standard curve equations for eight organic acids

图1　有机酸标准对照品HPLLCC图Fig.1 HPLC of standard reference substances of organic acids

2.2HPLC图谱分析

取草酸、奎宁酸、甲酸等10 种有机酸对照品溶液的混标溶液，进样10 μL，色谱图见图1。从图1可以看出，10 种对照品有机酸基本达到基线分离，峰形良好。取蓝莓样品蓝丰的样品溶液，进样10 μL，色谱图见图2。从图2可知，蓝莓果实的样品溶液中含有草酸、奎宁酸、甲酸、苹果酸、莽草酸、乳酸、乙酸、柠檬酸8种有机酸，各有机酸成分的分离度较好。

图2　蓝莓果实中有机酸HPLLCC图Fig.2 HPLC of organic acids in blueberries

2.3精密度实验结果

取有机酸对照品溶液，按1.3.3节色谱条件连续进样6 次，计算各有机酸峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果显示有机酸的RSD在1.17%～2.16%之间，表明所用仪器精密度良好。结果如表2所示。

表2　精密度实验结果Table 2 Precision for eight organic acids

2.4重复性实验结果

取品种蓝丰的果实，按1.3.2节的样品溶液制备方法分别提取6 份，按1.3.3节色谱条件分别进样，计算样品各有机酸峰面积的RSD，结果其RSD在0.53%～2.73%之间，表明该方法重复性良好。结果如表3所示。

表3　重复性实验结果Table 3 Repeatability for eight organic acids

2.5稳定性实验结果

取同一蓝莓样品提取液，按1.3.3节色谱条件，分别在放置0、2、4、8、12 h后进样分析，记录峰面积，计算样品各有机酸峰面积的RSD，结果显示其RSD在1.22%～3.89%之间，表明供试品溶液在室温条件下放置12 h稳定性良好，结果如表4所示。

2.6加样回收率实验结果

分别取9 份相同质量已知各有机酸含量的蓝丰果实样品按1.3.2节方法制备有机酸提取液，1 份加入纯净水作对照，其余8 份分别加入相同体积不同质量浓度的有机酸对照品溶液，完全混匀后经过0.45 μm微孔滤膜过滤，进样10 μL。各有机酸的平均回收率在96.8%～102.8%之间，表明方法准确率高，结果见表5。

表5　加样回收率实验结果（n=9）Table 5 Spiked recoveries for eight organic acids （n=9)

2.7蓝莓样品有机酸含量测定结果

按1.3.2节样品溶液制备方法和1.3.3节色谱条件，分别对不同品种蓝莓果实的有机酸含量进行HPLC含量分析，每个品种测定3 次，结果见表6。

2.8不同品种蓝莓中有机酸含量

图3　不同品种蓝莓中有机酸含量Fig.3 The contents of organic acids in different species of blueberry

表6　蓝莓中有机酸含量Table 6 The contents of various organic acids in blueberry

以各品种中含量最高的两类有机酸柠檬酸和奎宁酸计算，对比蓝莓果实中二者的量，可以反映出不同品种总有机酸的含量。由图3可知，总含量最高的品种是塞拉，最低的品种是克瑞顿。

3　讨论与结论

本研究利用HPLC法建立了同时测定蓝莓果实中8 种有机酸的方法，同时分析了大连栽培的26 个不同蓝莓品系中有机酸的类型和含量。蓝莓果实中主要以柠檬酸为主，占到所有有机酸含量的80%以上，其次为奎宁酸、苹果酸和草酸。从有机酸在蓝莓中的分布来看，北高丛蓝莓的21 个品种里，除乙酸在某些品种里未检测到之外，其他几个有机酸均含有；所测的半高丛蓝莓3 个品系里均含有8 种有机酸成分；而矮丛蓝莓中的美登品种也是不含乙酸。不同种类蓝莓间，有机酸的含量也有所不同，北高丛蓝莓有机酸整体含量要高于半高丛和矮丛蓝莓，但北高丛蓝莓不同品种间含量差异较大，其中含量最高的品种为塞拉，达25.135 26 mg/g鲜果，最低的品种为克瑞顿，仅含2.368 31 mg/g鲜果；而半高丛和矮丛蓝莓中各品种之间差别较小，含量较均一。

［1］ 全国中草药汇编编写组. 全国中草药汇编： 下册［M］. 北京： 人民卫生出版社， 1986： 597-598.

［2］ 刘会灵， 曹建新. 越橘属植物的研究进展［J］. 天然产物研究与开发，2009， 21（12）： 905-911.

［3］ 史海芝， 刘惠民. 国内外蓝莓研究现状［J］. 江苏林业科技， 2009，36（4）： 49-51.

［4］ ZHAO C， GIUSTI M M， MALIK M， et al. Effects of commercial anthocyanin-rich extracts on colonic cancer and nontumorigenic colonic cell growth［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004， 52（20）： 6122-6128.

［5］ HOSSEINIAN F S， BETA T. Saskatoon and wild blueberries have higher anthocyanin contents than other manitoba berries［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2007， 55（26）： 10832-10838.

［6］ LUCY Y， KEVIN Z， JOHN P. Antioxidant properties of coldpressed black caraway， carrot， cranberry， and hemp seed oils［J］. Food Chemistry， 2005， 91（4）： 723-729.

［7］ SINGH M， ARSENEAULT M， SANDERSON T， et al. Challenges for research on polyphenols from foods in Alzheimer’s disease：bioavailability， metabolism， and cellular and molecular mechanisms［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2008， 56（13）： 4855-4873.

［8］ KRISTO A S， KALEA A Z， SCHUSCHKE D A， et al. A wild blueberry-enriched diet （Vaccinium angustifolium） improves vascular tone in the adult spontaneously hypertensive rat［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2010， 58（22）： 11600-11605.

［9］ PRIOR R L， WILKES S E， ROGERS T R， et al. Purifi ed blueberryanthocyanins and blueberry juice alter development of obesity in mice fed an obesogenic high-fat diet［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2010， 58（7）： 3970-3976.

［10］ WILLIAMS L K， LI C， WITHERS S G， et al. Order and disorder：differential structural impacts of myricetin and ethyl caffeate on human amylase， an antidiabetic target［J］. Journal of Medicinal Chemistry，2012， 55（22）： 10177-10186.

［11］ SUH N， PAUL S， HAO X， et al. Pterostilbene， an active constituent of blueberries， suppresses aberrant crypt foci formation in the azoxymethane-induced colon carcinogenesis model in rats［J］. Clinical Cancer Research， 2007， 13（1）： 350-355.

［12］ BOATENG J， VERGHESE M， SHACKELFORD L， et al. Selected fruits reduce azoxymethane （AOM）-induced aberrant crypt foci （ACF）in Fisher 344 male rats［J］. Food and Chemical Toxicology， 2007，45（5）： 725-732.

［13］ BOIVIN D， BLANCHETTE M， BARRETTE S， et al. Inhibition of cancer cell proliferation and suppression of TNF-induced activation of NF kappa B by edible berry juice［J］. Anticancer Research， 2007，27（2）： 937-948.

［14］ PHILLIPS M M， CASE R J， RIMMER C A， et al. Determination of organic acids in Vaccinium berry standard reference materials［J］. Analytical and Bioanalytical Chemistry， 2010， 398（1）： 425-434.

［15］ FAN-CHIANG H J， WROLSTAD R E. Sugar and nonvolatile acid composition of blackberries［J］. Journal of Aoac International， 2010，93（3）： 956-965.

［16］ 杨朝霞. 有机酸分析方法之比较［J］. 酿酒科技， 2009， 141（9）： 18-20.

［17］ 徐云， 徐建， 王婷婷， 等. 功能性保健食品蓝莓的研究进展［J］. 食品研究与开发， 2013， 32（6）： 132-134.

［18］ 胡小露， 刘卉， 鲁宁， 等. HPLC法同时测定蓝莓汁及其发酵酒中9 种有机酸［J］. 食品科学， 2012， 33（16）： 229-232.

［19］ 成冰， 张京芳， 徐洪宇， 等. 不同品种酿酒葡萄有机酸含量分析［J］.食品科学， 2013， 34（12）： 223-228. doi： 10.7506/spkx1002-6630-201312046.

［20］ 高晓燕， 廖小军， 王善广， 等. 反相高效液相色谱法测定果汁中11 种有机酸条件的优化［J］. 分析化学， 2004， 32（12）： 1645-1648.

［21］ 徐月， 高慧， 贾天柱. HPLC测定五味子不同炮制品及不同部位有机酸含量［J］. 中国中医药信息杂志， 2014， 21（7）： 85-88.

［22］ 吕利华， 梁丽绒， 赵良启. 山西老陈醋中有机酸的HPLC测定分析［J］.食品科学， 2007， 28（11）： 456-459.

［23］ 戴胜， 张明， 程文明， 等. HPLC测定野菊花药材中8 种黄酮和有机酸的含量［J］. 中国中药杂志， 2013， 38（12）： 1961-1965.

［24］ 庞荣丽， 方金豹， 郭琳琳， 等. 水果果实中主要有机酸提取条件的优化［J］. 中国农业科学， 2014， 47（13）： 2625-2633.

［25］ 加列西·马那甫， 李俊芳， 德娜·吐热汗， 等. 葡萄中有机酸的提取工艺参数优化及同时测定［J］. 食品与生物技术学报， 2014， 33（7）：696-702.

［26］ 刘文静， 潘葳. 采用反相高效液相色谱法同时测定杨梅果实中的有机酸［J］. 热带作物学报， 2011， 32（1）： 172-175.

［27］ 魏鑫， 魏永祥， 刘成， 等. 高效液相色谱法测定4 个蓝莓品种果实中糖酸组分及含量［J］. 中国果树， 2013， 37（3）： 64-67.

［28］ ARNETOLI M， MONTEGROSSI G， BUCCIANTI A， et al. Determination of organic acids in plants of Silene paradoxa L. by HPLC［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2008， 56（3）：789-795.

Determination of Eight Organic Acids in Blueberries by HPLC

XU Yutao1， LI Keke1， WANG Hexin2， CHEN Lirong3， GONG Xiaojie1，*
（1. College of Medical， Dalian University， Dalian 116622， China； 2. Modernization of Agricultural Research Center， Dalian University，Dalian 116622， China； 3. College of Environmental and Chemical Engineering， Dalian University， Dalian 116622， China）

A high performance liquid chromatography （HPLC） method was established for the simultaneous determination of 8 organic acids in blueberry fruit extract. This method was then used to determine the contents of organic acids in blueberries from 26 cultivars. Among the blueberry cultivars tested， the content of total organic acids （25.135 26 mg/g fresh fruit） was highest in Sierra and lowest in Croaton （only 2.368 31 mg/g fresh fruit）. This method is simple， reproducible， accurate，reliable and useful for the analysis of organic acids in blueberries.

blueberry； organic acid； citric acid； high performance liquid chromatography （HPLC）； quantifi cation

O656.3；R917

A

1002-6630（2015）18-0127-05

10.7506/spkx1002-6630-201518023

2015-03-23

辽宁省科技厅科学技术计划项目（2013204001；2014204007）

徐玉涛（1990—），男，硕士研究生，研究方向为中药质量控制。E-mail：751133491@qq.com

弓晓杰（1963—），男，教授，博士，研究方向为中药新药开发。E-mail：gxjclr@163.com