超高效液相色谱-串联质谱法同时测定牛乳中3 类15 种抗生素残留

李一凡，王凤玲*，肖 瑶，彭 诚，郑 玲，闫宏昊，符 桢

（天津商业大学 天津市食品与生物技术重点实验室，生物技术与食品科学学院，天津 300134）

超高效液相色谱-串联质谱法同时测定牛乳中3 类15 种抗生素残留

李一凡，王凤玲*，肖 瑶，彭 诚，郑 玲，闫宏昊，符 桢

（天津商业大学 天津市食品与生物技术重点实验室，生物技术与食品科学学院，天津 300134）

建立牛乳中青霉素类、磺胺类、四环素类3 类 15 种抗生素残留量同时测定的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。样品经乙腈-水溶液（3∶1，V/V）提取、HLB固相萃取小柱净化、氮气吹干后用1.0 mL流动相溶解残余物。采用ZORBAX Ecliplus C18色谱柱，乙腈和5 mmol/L甲酸铵溶液（含体积分数0.2%甲酸）作流动相梯度，质谱选择多反应监测正离子模式测定，外标法定量。结果表明，15 种抗生素在相应的浓度范围内线性良好，相关系数均大于0.999；在3 个不同添加水平下，平均回收率为75.1%～103.7%，相对标准偏差为1.4%～7.3%，检出限（RSN≥3）和定量限（RSN≥10）分别为0.2～4.0 μg/kg和1.0～4.0 μg/kg。方法简便快速、灵敏度高，适合15 种抗生素同时检测，为牛乳中抗生素多残留测定提供了新的方法。

超高效液相色谱-串联质谱；抗生素；牛乳；残留量

近年来，抗素中的青霉素类、磺胺类、四环素类作为抗菌药被广泛应用于养殖行业中［1］。滥用这些药物造成牛乳严重污染，通过食物链在人体内蓄积，有些抗生素有致突变、致畸、致癌的严重危害，过量的抗生素将使细菌的耐药性增强［2-7］。国际食品法典委员会、欧美国家、日本和我国对这3 类药物的最高残留限量都在μg/kg级水平。

目前，国内外针对乳及乳制品抗生素残留检测方法有很多［8-14］，分别测定这3 类化合物的超高效液相色谱-串联质谱 （ultra high pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS-MS）法也较为成熟［15-19］。然而在当今养殖行业中，同时使用多类药物的现象较为普遍，因此建立药物多种残留测定的方法十分重要。虽然同时测定2 类或3 类药物的方法亦有报道［20-22］，但同时测定上述3 类药物在牛乳中残留的UPLC-MS-MS法尚未见报道。本研究采用UPLC-MS-MS测定，通过优化样品前处理及UPLC-MS-MS条件，建立了同时提取、动态多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）同时测定青霉素类、磺胺类、四环素类共3 类15 种牛乳中抗生素新方法。方法简便快速、灵敏可靠，可为牛乳中药物多残留的定性与定量分析提供技术保障。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

牛乳来源于天津、黑龙江、内蒙养殖场。

阿莫西林、磺胺二甲嘧啶标准品（纯度≥97%）中国兽药监察所；氨苄西林、哌拉西林、青霉素G、苯唑西林、氯唑西林、磺胺嘧啶、金霉素、土霉素标准品（纯度≥97%） 中国食品药品检定研究院；双氯西林、磺胺甲基嘧啶标准品（纯度≥97%） 美国Sigma公司；奈夫西林、磺胺噻唑、四环素标准品（纯度≥97%） 德国Dr Ehrenstorfer公司；乙腈（色谱纯）美国J.T.Baker公司；甲酸（色谱纯） 美国Alfa Aesar公司；实验室用水为超纯水。

1.2仪器与设备

1200 UPLC仪、6410A三重四极杆MS仪 美国Agilent公司；ME215P电子天平 德国Sartorius公司；PHB-4 pH计 上海雷磁仪器厂；HC-2517高速离心机科大创新股份有限公司；ZH-2涡旋振荡器 天津药典标准仪器公司；KD200氮气吹扫仪 杭州奥盛仪器有限公司；HG-930A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；AS10200A超声清洗机 广东昆山仪器有限公司；Milli-Q水纯化系统 美国Millipore公司。

1.3方法

1.3.1提取

精密称取4 g（精确至0.000 1 g）均质生鲜乳置于50 mL具塞离心管中，加入20 mL乙腈-水（3∶1，V/V）溶液，涡旋振荡2 min，超声提取10 min，15 000 r/min离心10 min，将上清液过滤转移到鸡心瓶，重复提取一次，将乙腈水层合并。45 ℃减压浓缩至3 mL左右，用乙腈-水（3∶1，V/V）溶液转移并定容至10 mL。

1.3.2净化

将HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL）用5 mL甲醇、5 mL水活化后，将10 mL提取液过HLB固相萃取柱，待样液完全流出后，依次用5 mL水、2 mL体积分数5%甲醇溶液淋洗小柱，用10 mL甲醇洗脱，全过程控制流速不超过2 mL/min，收集洗脱液，45 ℃水浴氮气吹干。用1.0 mL流动相定容，溶液经0.22 μm滤膜过滤后，供超UPLC-MS-MS测定。

1.3.3标准溶液的配制

1.3.3.1标准工作液配制

青霉素类标准储备溶液：准确称量青霉素类标准品各0.025 0 g，用乙腈-水（3∶1，V/V）溶液溶解配制成质量浓度为100.0 μg/mL的储备液，4 ℃冰箱内避光保存，备用。

磺胺和四环素类标准储备溶液：准确称量标准品各0.025 0 g，用甲醇溶液配制成质量浓度为100.0 μg/mL的储备液，4 ℃冰箱内避光保存，备用。

1.3.3.2混合标准中间工作液的配制

准确移取适量按1.3.3.1节配制的15 个100.0 μg/mL标准储备液，配成1.0 μg/mL混合标准中间工作液，用于添加回收实验和配制标准溶液系列，0～4 ℃条件下避光保存。

1.3.3.3混合标准溶液的配制

分别准确移取一定体积的混合标准中间工作液，可根据需要用流动相稀释成适当质量浓度的混合标准工作液。现用现配。

1.3.4UPLC-MS-MS分析

1.3.4.1UPLC条件

色谱柱：A g i l e n t Z O R B A X E c l i p l u s C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；流动相A：5 mmol/L甲酸铵溶液（含体积分数0.2%甲酸），流动相B：乙腈；梯度洗脱见表1；流速：0.2 mL/min；进样量：15 μL；柱温：30 ℃。

表1　梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

1.3.4.2MS条件

表2　15 种抗生素残留检测的UPLC-MS-MS仪器参数Table 2 UPLC-ESI MS-MS parameters for analysis of 15 antibiotics

离子源：电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压4 000 V；雾化气流速11.0 L/min；雾化气压力241.15 kPa；干燥气温度350 ℃；扫描方式：多反应监测模式；15 种抗生素定性离子、定量离子、碎裂电压、碰撞能量参数见表2。

2　结果与分析

2.1方法学建立

2.1.1前处理条件优化

根据牛乳中蛋白质含量高的特点，需要选择合适的沉淀剂去除蛋白，减小或去除干扰。分别提取这 3类化合物的方法已有国家标准［22-24］作为支持，但是否适用于15 种药物的同时提取需要进行考察。实验比较了不同体积比的乙腈溶液、5%高氯酸溶液、0.1 mol/L Na2EDTAMcllvaine缓冲溶液、10%三氯乙酸溶液、5%磷酸溶液为提取溶剂的提取效果，发现5%高氯酸溶液，离心后溶液中有絮状物出现，不利于净化，且氮吹过程腐蚀性大；0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，提取液出现胶体层，离子化效率相对较低；5% 磷酸溶液提取，离心后溶液分层，上层呈油状，旋蒸后溶液呈乳白色，不易过滤；10%三氯乙酸溶液提取离心后，所得溶液澄清，但浓缩时需要温度较高，影响抗生素的稳定性，回收率低；乙腈-水（3∶1，V/V）和10%三氯乙酸溶液沉淀蛋白的效果较好。经MS仪测定后，采用乙腈-水（3∶1，V/V）溶液进行提取，提取效果和回收率都较高。

使用体积比为1∶1、3∶1、5∶1 乙腈-水溶液，当乙腈-水（1∶1，V/V）时，沉蛋白效果不佳，3∶1与5∶1效果相近，但3∶1时，阿莫西林和氨苄西林的提取率明显高于5∶1。

2.1.2色谱条件的优化

实验比较了C18和C8色谱柱对色谱分离效果和响应值的影响，C18色谱柱测定时，萘夫西林、磺胺噻唑、金霉素的响应值明显高于C8色谱柱，且所用目标成分分离效果也优于C8柱；流动相种类和比例选择，遵从分离效果最好、离子化效率高、MS检测灵敏度高的原则，流动相种类比较了甲醇、乙腈和不同比例的甲醇-乙腈作为有机相，发现部分化合物在含甲醇的有机相中峰形或响应值较差。水相考察了添加不同体积分数的甲酸及甲酸铵的影响，加入甲酸可以适当减少出峰拖尾，加入甲酸铵能消除峰的前延。最终选择含5 mmol/L甲酸铵溶液（含体积分数0.2%甲酸）为流动相A，乙腈为流动相B；考察了不同洗脱梯度对15 种抗生素的保留时间和MS图效果影响，结果显示，采用表1条件下洗脱梯度效果峰形对称、半峰宽窄、丰度高，检测时间短。

2.1.3MS条件的优化

图1　青霉素类、磺胺类和四环素类15 种抗生素MRMM图Fig.1 MRM chromatograms of 15 antibiotics standards

根据待测物的化学结构，均适合在ESI源正离子模式下进行离子化，其母离子为［M+H］+。将15 种标准品储备液用流动相稀释成质量浓度为0.5～1.0 μg/mL的标准品混合溶液。在ESI源正离子模式下，分别对待测物进行MS参数优化。根据目标物质的相对分子质量，通过MS2SIM优化碎裂电压使［M+H］+的响应最大；对母离子作Product Ion扫描优化得到最适碰撞电压，使定量离子MS响应值最大。利用优化后的色谱条件和MS条件，测定15 种抗生素混合标准溶液，其色谱图MRM见图1。

2.2线性回归方程及检出限

根据每种抗生素类药物的灵敏度，用空白基质溶液配成一系列质量浓度混合标准工作溶液，在所建立的色谱条件和MS条件下测定，以抗生素峰面积对被测组分的质量浓度作图，确定了15 种抗生素的线性范围、线性方程，结果见表3。

表3　15 种抗生素线性范围、线性方程、线性相关系数、检出限和定量限Table 3 Regression equations with linear ranges and correlation coeffifi cients， and limits of detection and quantififi cation for 15 antibiotics

由表3可见，阿莫西林和苯唑西林的线性范围是5～100 ng/mL，其他13 种抗生素的线性范围是2～100 ng/mL；标准曲线的线性相关系数均大于0.999；方法检出限（RSN≥3）为0.2～4.0 μg/kg，定量限（RSN≥10）为1.0～4.0 μg/kg。利用国标方法测定相同样品，3 类抗生素的线性范围是5～90 ng/mL，说明建立的测定方法优于国标方法。

2.3回收率实验

在空白牛乳样品中添加标准溶液进行回收率测定。分别添加5.0、10.0、50.0 μg/kg 3 个水平，每个水平进行5 次重复测定，回收率实验结果见表4。

表4　15 种抗生素类药物回收率实验结果（n=5）Table 4 Recovery rates of 15 antibiotics in blank milk （n= 5）%

由表4可见，3 个水平平均加标回收率为75.1%～103.7%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.4%～7.3%，利用国标方法测定相同样品，3 类抗生素的加标回收率范围为69.8%～102.7%。结果表明，所建立的方法可以同时测定牛乳中3 类15 种抗生素残留，并且回收率优于国标方法的测定。

2.4实际样品测定

采用所建立的方法和国家标准［23-25］对实验室采集到的98 个牛乳样品进行15 种抗生素药物残留的检测，均未检出。随机抽取98 份样品中的5 份样品作为空白样品基质进行加标回收率实验，每份样品添加5.0 μg/kg标准品，加标回收率测定结果见表4。结果表明，加标回收率在75.3%～99.7%，人工添加的样品中有检出，说明建立的方法有效。

3　结 论

本实验按照鲜牛乳中抗生素残留检测要求，分别对鲜牛乳样品的前处理方法、UPLC-MS-MS条件进行了优化，确定了UPLC-MS-MS法同时测定3 类15 种抗生素残留的检测条件。所建立的方法克服了单类检测的局限性，满足分析时间短、检出限低、线性范围宽、回收率高的方法学要求，适合牛乳中 3 类15 种抗生素残留同时定量分析。

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Simultaneous Determination of 15 Antibiotics Residues in Milk by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

LI Yifan， WANG Fengling*， XIAO Yao， PENG Cheng， ZHENG Ling， YAN Honghao， FU Zhen
（Tianjin Key Laboratory of Food and Biotechnoloy， College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce， Tianjin 300134， China）

A new approach for the simultaneous determination of residues of three classes of antibiotics， i.e.， penicillins，sulfoamides and tetracyclines， in milk by ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （UPLC-MSMS） was established. Samples were extracted with acetonitrile-water （3：1， V/V）， cleaned up using an HLB SPE cartridge and blown to dryness under nitrogen and the residues were then dissolved in 1.0 mL of mobile phase. A total of 15 analytes were separated on ZORBAX Ecliplus C18column with a mobile phase composed of acetonitrile and 5 mmol/L formic ammonium acetate solution containing 0.2% formic acid with gradient elution， detected by ESI-MS/MS and quantifi ed by the external standard method. The correlation coefficients of the linear calibration curves were over 0.999 in the corresponding concentration range. The average recoveries of the 15 analytes ranged from 75.1% to 103.7%， with relative standard deviations （RSDs） at three spiked concentrations of 1.4%-7.3%. The limit of detection （LOD， RSN≥3） and quantifi cation（LOQ， RSN≥ 10） were 0.2-4.0 and 1.0-4.0 μg/kg， respectively. The new method is simple， fast， sensitive and reliable， and it is suitable for the determination of antibiotic residues in milk.

ultra high pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry； antibiotics； milk； residues

TS207.5

A

1002-6630（2015）18-0204-05

10.7506/spkx1002-6630-201518038

2014-11-20

李一凡（1992—），女，硕士研究生，研究方向为食品安全检测。E-mail：421338431@qq.com

王凤玲（1965—），女，高级实验师，硕士，研究方向为食品质量与安全。E-mail：wfl ing@tjcu.edu.cn