鲜切水芹贮藏期间微生物生长模型及货架期预测

田梦琦，杨润强，庄 言，顾振新

（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

鲜切水芹贮藏期间微生物生长模型及货架期预测

田梦琦，杨润强，庄 言，顾振新*

（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

利用选择性培养基进行鲜切水芹贮藏期菌相分析，发现假单胞菌属是其贮藏期优势菌。保鲜袋挽口包装的鲜切水芹在22 ℃贮藏8 d，假单胞菌数量即达到106CFU/g，低温贮藏有助于抑制假单胞菌的生长繁殖。修正的Gompertz模型能有效地拟合出4 ℃和22 ℃条件下假单胞菌属细菌的动态变化，偏差度和准确度分析表明所建立的模型是有效的。鲜切水芹于低温贮藏3 d后置于常温（22 ± 1） ℃贮藏时，叶绿素和木质素动态变化符合一级模型，在实际应用中，可根据腐败菌的生长速率来预测鲜切水芹的货架期。

鲜切水芹；贮藏；微生物；货架期

新鲜蔬菜经过切割后，大量的营养物质外流，增加了微生物侵染机会，导致品质下降，货架期缩短。引起新鲜蔬菜及其鲜切产品腐烂变质的微生物主要为细菌和霉菌［1］。常见的细菌有假单胞菌属、葡萄球菌属、肠杆菌属、肠球菌属等，不同蔬菜上的细菌群落差别很大。

近年来，国内外大量研究了微生物预测模型在食品质量控制中的应用。Jacxsens等［2］把预测模型应用于检测温度变化对气调平衡包装鲜切蔬菜的微生物特性和感官特性的影响，认为贮藏温度的控制是其中最重要的因素。Pirovani等［3］建立了新鲜菠菜在清洗过程中有效氯的消耗和微生物总菌数减少情况的预测模型。Koseki等［4］用预测模型评估1～10 ℃条件下新鲜莴苣和甘蓝的微生物生长情况，建立了最适合的Gompertz函数模型。国内众多学者也分别建立了鲜切生菜［5］、苹果［6］、莲藕［7］等在贮藏期间的微生物生长模型，但关于水芹的微生物生长模型暂未报道。

食品货架期是指食品被贮藏在推荐的条件下，能够保持安全与理想的感官、理化和微生物特性及保留标签声明的营养值的时间［8］。对食品货架寿命终点的评价必须综合考虑包括微生物、质地、感官、营养成分等变化。采后水芹含水量高、代谢旺盛、质地脆嫩、极易遭受机械损伤导致褐变、脱绿、黄化等，组织迅速失水萎缩、木质化，而水芹鲜切的过程增加了微生物接触的机会，易于腐烂。因此，鲜切水芹货架期评估需综合考量其理化、微生物和感官指标。

针对鲜切水芹存在的微生物污染风险，本实验研究了培养基对引起鲜切水芹各菌属菌相变化情况，确定了优势菌，探讨了在低温和常温贮藏条件下鲜切水芹优势菌菌落数随贮藏期的动态变化，建立了相应的Gompertz函数模型；以鲜切水芹在低温贮藏3 d后放置在常温条件下销售为例，研究其叶绿素与木质素含量、优势菌数、感官质量的动力学，据此建立了鲜切水芹货架期预测模型，为鲜切水芹的贮藏与流通提供了理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

水芹，品种为大圣长白水芹，产自南京市六合区大圣村，带根采收，采后立即运回实验室。挑选鲜绿、干净、无机械损伤、无病虫害、大小粗细和长度基本一致的水芹备用。

胰蛋白胨、营养琼脂、酵母浸粉、葡萄糖、NaCl、吐温 国药集团上海化学试剂厂；假单胞分离琼脂、结晶紫中性红胆盐琼脂VRBGA、甘露醇高盐琼脂、孟加拉红培养基、肠球菌培养基 青岛高科技园海博生物技术有限公司。

1.2仪器与设备

DHG-9030A鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司；FA/JA电子天平 上海精密科学仪器有限公司；KQ-250DB数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；恒温培养箱 宁波海曙赛福实验仪器厂。

1.3方法

1.3.1微生物菌群分析

随机取300 g水芹，切成25 cm鲜切段，用打有5孔的聚乙烯复合保鲜袋挽口包装后于常温（22±1）℃贮藏10 d，每隔2 d考察各菌属菌落数。

1.3.2优势腐败菌生长预测模型建立

随机取2 组水芹，每组300 g，均切成25 cm鲜切段，用打有5孔的聚乙烯复合保鲜袋挽口包装后于低温（4 ± 1）℃和常温（22 ± 1） ℃贮藏。每隔1 d测定优势菌菌落数，每处理重复3 次。之后，采用Matlab软件建立Gompertz函数模型。

1.3.3货架期预测模型

以鲜切水芹在低温贮藏3 d后置于常温（22 ± 1） ℃销售为例，测定其叶绿素含量、木质素含量、优势菌数和感官质量的动力学，并建立相关数学模型。之后，基于此4 个指标模型分别建立了鲜切水芹在设定的模拟流通环节下的货架期预测模型。

1.3.4指标测定

1.3.4.1水芹微生物分离

无菌操作条件下取水芹10 g，放入装有 225 mL无菌生理盐水和适量无菌玻璃珠的锥形瓶中均质，吸取1 mL 悬液进行稀释，每种选择性培养基取3 个合适的稀释梯度倒平板。培养基和培养条件见表1。

表1　水芹中各种菌的选择性培养基及培养条件Table 1 Selective medium and culture conditions for all species of bacteria from cress

1.3.4.2水芹贮藏期间菌相变化规律

采用选择性培养基对水芹于22 ℃贮藏10 d内菌落总数、假单胞菌属、肠杆菌科、肠球菌、葡萄球菌以及霉菌和酵母菌进行平板计数，微生物培养条件同表1。

1.3.4.3优势菌菌落数

参照GB/T 5009.1—2003《食品卫生检验方法》中倒平板法测定。

1.3.4.4优势菌生长模型的建立

应用修正的Gompertz模型［9］对鲜切水芹优势菌的生长曲线进行拟合，估计生长曲线的最大比生长速率和迟滞时间。

式中：t为时间；Nt为t时的菌数/（CFU/g）；Nmax、N0分别为最大和初始菌数/（CFU/g）；e为常数2.718；μmax为微生物生长的最大比生长速率/d-1；λ为微生物生长的延滞时间/d。

应用Excel 2003统计所有数据，用Matlab软件对上述的Gompertz方程进行拟合，并绘图建立生长模型。

1.3.4.5优势菌生长模型的可靠性评价

用准确度（accuracy factor，Af）和偏差度（bias factor，Bf）来判定模型精确度［10］。将优势菌生长动力学模型求得的预测值与实验所得的数值代入式（2）、（3）求得Af与Bf。

式（2）、（3）中：Npredicted为预测值；Nobserved为实测值；n为实验次数。Bf在0.90～1.05间表明模型准确因子高，误差小；在0.70～0.90及1.06～1.15间表明模型精确度可接受，但误差较大；小于0.70或大于1.15表明模型不可靠，不能用于模拟描述微生物生长等状况。

1.3.4.6货架期预测模型的建立

鲜切水芹低温冷藏3 d后，测定其叶绿素、木质素、优势菌数和感官质量作为常温货架期预测的初始值。之后，测定常温贮藏10 d内上述4 项指标的动力学，并建立相关数学模型。基于该数学模型，可获得鲜切水芹在设定的模拟流通环境下的货架期预测模型。

1.3.4.7感官评定

参考数字化评分方法［5，11］进行评定，根据水芹可食茎特点，具体评分指标见表2，评分时按加权系数，色泽50%，质地50%。5 分以下为感官拒绝，不可接受。

表2　感官评定评分表Table 2 Criteria for sensory evaluation of fresh-cut cress

1.3.4.8叶绿素和木质素含量测定

参照文献［12］方法，将25 cm长鲜切水芹切成1 cm长小段，充分混匀。随机称取5 g样品剪碎，放入研钵中，加入0.2 g碳酸钙粉末及2 mL 95%乙醇溶液研磨，再加95%乙醇溶液3 mL继续研磨至组织变白，静置5 min。将匀浆液过滤到25 mL棕色容量瓶中，用少量95%乙醇溶液冲洗研钵、研棒及残渣数次，一起过滤至容量瓶中。用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿素全部洗入容量瓶，直至滤纸无色，定容至刻度。以95%乙醇溶液为空白，分别在波长665 nm和649 nm处读取吸光度。叶绿素含量C按式（4）计算：

参照Luo等［13］方法并略作修改。将25 cm长鲜切水芹切成1 cm长小段，混匀，于50 ℃烘干至恒质量后粉碎，称取水芹干粉末0.1 g（m1）放入研钵，加入4 mL 72% H2SO4溶液搅拌至无块状，室温静置4 h后将混合液转移至250 mL平底烧瓶中，加入蒸馏水153 mL，将烧瓶放置在电炉上冷凝回流煮沸2 h。用已恒质量（m2）的滤纸抽滤，再将盛有木质素的滤纸于60 ℃烘至恒质量，取出称质量（m3），计算公式见式（5）：

1.4数据统计与分析

2　结果与分析

2.1水芹中微生物组分初步分析及优势菌的确定

2.1.1水芹中微生物的初步分析

图1　鲜切水芹各菌属平板菌落生长情况Fig.1 The growth of each microfl ora colony from cress on agar plates

由图1可知，鲜切水芹中的常规微生物种类有霉菌、酵母菌、肠杆菌属、假单胞菌属和葡萄球菌属，这些均是国标中规定的常规检测微生物种类，肠球菌选择性培养基上未长出肠球菌菌落。

2.1.2水芹贮藏期间菌相变化规律

图2　鲜切水芹22 ℃贮藏期间菌相变化Fig.2 Effect of storage time on the microflora of fresh-cut cress stored at 22 ℃

由图2可知，水芹贮藏期间菌落总数、霉菌和酵母菌、葡萄球菌属和肠杆菌属菌落数均随贮藏时间延长先上升后平稳，呈类“S”型曲线；而假单胞菌属数在贮藏前8 d逐渐增加，然后略有下降，而霉菌和酵母菌以及肠杆菌数量处于急剧增加的时期。贮藏前8 d，假单胞菌属的数量和生长趋势最接近菌落总数，是该时间段的优势菌；霉菌和酵母菌在贮藏8 d后竞争性较强，假单胞菌则处于生长劣势。贮藏8 d时，鲜切水芹出现明显的肉眼可见的腐烂和褐变。综合考虑，确定假单胞菌属作为鲜切水芹贮藏期的优势腐败菌。

2.2不同贮藏温度条件下水芹假单胞菌属生长模型

2.2.1模型的建立

图3　4 ℃贮藏鲜切水芹假单胞菌属生长拟合曲线Fig.3 The growth curve of Pseudomonas in fresh-cut cress stored at 4 ℃

图4　22 ℃贮藏鲜切水芹假单胞菌属生长拟合曲线Fig.4 The growth curve of Pseudomonas in fresh-cut cress stored at 22 ℃

贮藏温度对鲜切水芹假单胞菌属数量影响显著，4 ℃条件下水芹贮藏20 d后假单胞菌属数量才达到106的数量级，在贮藏前17 d，其数量均小于106CFU/g（图3）；在22 ℃条件下贮藏时，假单胞菌属数量短时间内急剧增长，贮藏7 d后便超过106CFU/g（图4）。可见，低温贮藏有助于抑制假单胞菌的生长繁殖，对应的生长曲线拟合方程4 ℃见式（6），22 ℃见式（7）：

表3　4 ℃和22 ℃贮藏期间鲜切水芹假单胞菌生长动力学参数Table 3 The growth parameters of Pseudomonas obtained from Gompertz function

2个贮藏温度条件下假单胞菌的生长曲线参数如表3所示，贮藏温度越高，假单胞菌的最大比生长速率μ（d-1）越大，22 ℃是4 ℃的1.94 倍；生长的延滞时间λ随温度升高而缩短，4 ℃条件下的延滞时间为6.55 d，而22 ℃为0.78 d。

2.2.2模型的可靠性评价

表4　生长曲线模型的Af和BfTabllee4 Af aanndd Bf value of the growth curve model

由表4可知，实测值与预测值基本吻合，4 ℃贮藏的模型Af和Bf分别为1.039和0.990；22 ℃的模型Af和Bf分别为1.036和0.972，表明建立的Gompertz数学模型能有效预测鲜切水芹在4 ℃和22 ℃贮藏时假单胞菌属的生长动态。

2.3鲜切水芹货架期预测模型

以鲜切水芹在低温（4 ℃）贮藏3 d后放置在常温（22 ℃）销售为例，测定其叶绿素含量、木质素含量、优势菌数、感官质量的动力学变化，据此分别建立鲜切水芹货架期预测模型。先测定低温放置3 d后的水芹叶绿素含量、木质素含量、优势菌数和感官质量，此为模拟流通常温销售下的初始值，即货架期考察第0天的值，在此基础上建立4 个指标对应的动力学模型。

食品的品质与时间关系通常表现出零级模型或一级模型，见式（8）：

式中：At为果蔬在任意时刻的品质；A0为果蔬的初始品质（t=0）；k为与温度有关的品质变化常数；t为贮藏时间。

2.3.1叶绿素动力学模型

图5　22 ℃贮藏鲜切水芹叶绿素动力学零级（A）和一级（B）模型Fig.5 Zero- and fi rst-order kinetic models of chlorophyll changes of fresh-cut cress stored at 22 ℃

由图5可知，零级模型的回归决定系数R2为0.983 9，一级模型的R2为0.985 7，2 个值均大于0.98，可见2 个模型均具有很高的拟合精度，即实测值和预测值有很高的一致性。由于一级模型R2大于零级模型R2，故采用一级模型拟合叶绿素的变化更佳，即lnAt= 0.799-0.119 5t，式中：At为不同时间t时水芹的叶绿素含量。则常温销售下鲜切水芹叶绿素含量C（mg/g）随贮藏时间t变化的预测模型为C = e（0.799-0.1195t）。

2.3.2木质素动力学模型

图6　22 ℃贮藏鲜切水芹木质素动力学零级（A）和一级（B）模型Fig.6 Zero- and fi rst-order kinetic models of lignin change of fresh-cut cress stored at 22 ℃

由图6可知，零级模型的回归决定系数R2为0.970 4，一级模型的R2为0.982 9，2 个值均大于0.97，可见2 个模型均具有很高的拟合精度，即实测值和预测值有很高的一致性。由于一级模型R2大于零级模型R2，故采用一级模型拟合木质素的变化更佳，即lnAt=2.702 5+0.051 9t，式中：At为不同时间t时水芹的木质素含量。则常温销售下鲜切水芹木质素含量L（%）随贮藏时间t变化的预测模型为L=e（2.7025+0.0519t）。

2.3.3感官质量动力学模型

图7 22 ℃贮藏鲜切水芹感官质量动力学零级（A）和一级（B）模型Fig.7 Zero- and fi rst-order kinetic models of sensory quality change of fresh-cut cress stored at 22 ℃

图7显示，零级模型的回归决定系数R2为0.990 8，一级模型的R2为0.985，2 个值均大于0.98，可见2 个模型均具有很高的拟合精度，即实测值和预测值有很高的一致性。由于零级模型R2大于一级模型R2，故采用零级模型拟合感官质量的变化更佳，即At=-0.046 5t2-0.444t+ 9.829 1，式中：At为不同时间t时水芹的感官质量SQ，则常温销售条件下鲜切水芹感官质量SQ （10 分制）随贮藏时间t（d）变化的预测模型为SQ =-0.046 5t2-0.444t+9.829 1。

2.3.4假单胞菌属动力学模型

对于优势菌假单胞菌属，由图3可知，鲜切水芹低温放置3 d后，假单胞菌属数量无显著变化，与图4常温贮藏水芹假单胞菌属数量初始值一致，故放置在常温销售的鲜切水芹假单胞菌属动力学模型可采用常温贮藏时假单胞菌的Gompertz生长模型，见式（9）：

2.3.5模拟商业流通条件下鲜切水芹货架期预测

表5　模拟商业流通条件下鲜切水芹货架期预测Table 5 The shelf-life prediction models of fresh-cut cress under commercial circulation conditions

由鲜切水芹叶绿素含量、木质素含量、感官质量和优势菌的动力学模型计算出的对应的货架期t，见表5。由于目前水芹产品缺乏相应国标或行业标准，故可以根据消费者对产品的感官评价或品质要求，如叶绿素含量、木质化程度等来获得一个临界值，将这个临界值代入相应指标的货架期预测模型中可以推算出对应的货架期。另外，根据优势菌数量要求，也可以推算出货架期。为了更直接地表述该预测模型下得到的实际货架期，参考叶绿素和木质素在（22±1）℃贮藏第10天时的值作为临界值，以推算出鲜切水芹在模拟商业流通下对应的货架期（表5）。感官评价在5 分以下时为“不可接受”。但在实际应用中，可根据腐败菌的生长速率来预测鲜切水芹的货架期。

3　讨论与结论

新鲜蔬菜经切割后，组织结构被破坏，导致营养液外流、自然抵抗力降低，切分表面不仅为微生物的侵染创造了环境，还为微生物提供了充足的水分和营养。因此，微生物污染是引起鲜切蔬菜品质劣变和腐败的主要因子［14］。研究表明，真空包装的鲜切莲藕于4 ℃贮藏10 d后，优势腐败菌总数增加到107CFU/g［15］；鲜切甘蓝10 ℃贮藏7 d后，细菌总数也从104CFU/g升高到108CFU/g［16］。本研究中，保鲜袋挽口包装的鲜切水芹在22 ℃贮藏7 d后，细菌总数即从103CFU/g上升到106CFU/g，这个升高幅度显著低于10 ℃贮藏的鲜切甘蓝，这主要与蔬菜种类和贮藏环境有关。这些结果均表明，鲜切蔬菜贮藏期间微生物生长繁殖旺盛。

鲜切蔬菜表面的微生物数量通常在103～106CFU/g之间［17］，迄今已分离鉴定出的微生物种类主要是假单胞菌属、欧文氏菌属、肠杆菌属、乳酸菌属等，也有一定量的霉菌和酵母菌，不同种类和品种的蔬菜中主要的污染微生物种类及数量差异较大。研究发现，假单胞菌属在污染蔬菜的微生物中占50%～90%［18］。本研究鲜切水芹中的优势菌是假单胞菌属，水芹22 ℃贮藏8 d后，其含量突破106CFU/g，鲜切紫甘蓝和西兰花中的主要腐败菌也是假单胞菌属，占其总菌数的70%左右［19］。然而，Tournas［20］分析出酵母菌是华盛顿地区39种鲜切蔬菜中的主要微生物，数量最高达到4.0×108CFU/g。假单胞菌属是一类专性需氧的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌，呈杆状或略弯，具端鞭毛，能运动，不发酵糖类，通常最适生长温度为30 ℃左右。假单胞菌在低温条件下也能生长，能分泌果胶酶，降解果胶，从而破坏细胞组织，危害冷藏的果蔬［21］。

目前，国内外对微生物预测模型在鲜切果蔬质量控制中的应用进行了大量的研究。刘新有等［22］在实验中建立的Gomperts模型能有效拟合不同贮藏温度条件下鲜切苹果中菌落总数的动态变化，从而能预测不同贮藏温度及时间内鲜切苹果中的菌落总数。Corbo等［23］认为Gomperts数学模型能很好地拟合鲜切梨中酵母菌、乳酸菌在4、8、12、20 ℃的生长规律。有学者比较了Gompertz、Richards、Stannard、Schnute、Logistic等模型在拟合微生物生长“S”型曲线上的应用效果，发现只有修改后的Gompertz模型拟合效果最佳［24］。本研究也利用修改后的Gompertz模型建立了鲜切水芹假单胞菌属的生长曲线模型，能够有效地拟合出4 ℃和22 ℃两个温度条件下假单胞菌属的动态变化。

低温贮藏可以显著降低鲜切蔬菜的呼吸速率，减少酶促代谢，并抑制微生物的生长繁殖，从而延长货架期。研究［25］表明，鲜切猕猴桃在2 ℃条件下贮藏7 d 的细菌总数比在20 ℃条件下贮藏 4.5 d 少 2 个数量级。本研究结果显示，4 ℃条件下鲜切水芹贮藏20 d后假单胞菌属数量达到106CFU/g，而在22 ℃条件下贮藏时，假单胞菌属数量短时间内急剧增长，贮藏7 d即超过106CFU/g，同时，4 ℃条件下假单胞菌生长速率显著低于22 ℃。

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Microbial Growth Model and Shelf-Life Prediction of Fresh-Cut Cress during Storage

TIAN Mengqi， YANG Runqiang， ZHUANG Yan ， GU Zhenxin*（College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Pseudomonas was found to be the dominant bacteria of fresh-cut cress during storage when microfl ora analysis of cress was performed using selective medium. Fresh-cut cress was packaged in sealed bags and then stored for 8 d at 22 ℃and the number of Pseudomonas reached 106CFU/g. The results showed that low temperature storage inhibited the growth and reproduction of Pseudomonas. A modifi ed Gompertz model could fi t effectively the dynamic changes of Pseudomonas count at 4 and 22 ℃. The deviation factor and accurate factor showed that the model was effective. The dynamic changes of chlorophyll and lignin in fresh-cut cress during storage for 3 day at low temperature followed by at room temperature （22 ± 1） ℃ could be fi tted to a fi rst-order kinetic model. The shelf-life of fresh-cut cress can be predicted according to the growth rate of spoilage bacteria in actual application.

fresh-cut cress； storage； microorganism； shelf-life

TS255.3

A

1002-6630（2015）18-0231-06

10.7506/spkx1002-6630-201518043

2015-04-14

“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD27B03）；江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）

田梦琦（1991—），女，硕士研究生，研究方向为食品中功能成分的富集技术。E-mail：2014808092@njau.edu.cn

顾振新（1956—），男，教授，博士，研究方向为生物技术与功能食品。E-mail：guzx@njau.edu.cn