CDK2-AP1通过调控细胞周期抑制乳腺癌生长

何向明 黄润 俞洋 向华 杨红健 宗祥云★

·论著·

CDK2-AP1通过调控细胞周期抑制乳腺癌生长

何向明 黄润 俞洋 向华 杨红健 宗祥云★

目的 探讨CDK2-AP1在乳腺癌的作用及其机制。方法 分别在正常乳腺组织及不同分期乳腺癌组织中检测CDK2-AP1的表达情况；进行CDK2-AP1的LOF & GOF细胞功能实验；接种CDK2-AP1干扰或过表达的乳腺癌细胞及对照细胞在裸鼠观察成瘤及相应指标。结果 在乳腺癌存在CDK2-AP1表达降低/缺失而CDK2/CyclinD1表达升高的情况，且CDK2-AP1的表达在正常乳腺组织细胞、乳腺导管原位癌、侵袭性乳腺癌、复发转移性乳腺癌渐次降低（P＜0.001），与CDK2/CyclinD1相反。体内、外实验均发现抑制CDK2-AP1表达后乳腺癌细胞周期后移、增殖加快；过表达CDK2-AP1的乳腺癌细胞周期阻滞在G0/G1和G2/M期，生长受抑制、裸鼠成瘤速度及大小均受抑制。结论 CDK2-AP1的表达降低以至缺失促进乳腺细胞进入恶性增殖形成肿瘤，缺乏细胞周期负性调控的乳腺癌细胞增殖能力增强。

乳腺癌 CDK2-AP1 细胞周期

细胞周期激酶2相关蛋白1（CDK2-AP1）是CDK2基因的特异性负向调节蛋白，文献报道其表达降低引起TGF-β-Smad 信号通路失活，导致细胞恶性增殖。且在化疗药物介导的DNA损伤过程中通过调节CDK2的活性影响肿瘤细胞凋亡［1～5］。CDK2-AP1表达降低还可能与口腔鳞癌、胃癌、食管癌以及前列腺癌的生长、预后有关［6～8］。CDK2-AP1基因在乳腺癌的作用很少报道，本文探讨CDK2-AP1与乳腺癌发生发展的关系。

1　材料和方法

1.1组织标本检测 随机抽取浙江省肿瘤医院组织库标本209例，其中正常乳腺组织40例、乳腺导管原位癌30例、浸润性导管癌121例、复发转移性乳腺癌18例。石蜡切片脱蜡、脱水后免疫组化检测CDK2-AP1表达。染色强度分两组：阳性：＞20%肿瘤细胞染色。阴性：≤20%肿瘤细胞染色。

1.2方法 （1）质粒构建：CDK2-AP1全长cDNA由人脑组织PCR扩增获得，通过连接酶反应直接连入酶切后的慢病毒表达载体CMV启动子下游，基因测序选出重组CDK2-AP1基因表达序列正确的载体。CDK2-AP1上、下游扩增引物分别为5'-AGCATGGCAACGTCTTCACAGT-3'、5'-TGGCATTCCGTTCCGTTTCT-3'；CDK2-AP1特异性siRNA序列为5'-GCTGCTGGCCATCATTGAAGA-3'，对照片段序列为5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。siRNA寡核苷酸退火后连接到pLV3载体生成CDK2-AP1 shRNA和对照shRNA表达质粒。（2）病毒包装 用Qiagen公司质粒抽提试剂盒提取慢病毒包装系统中CDK2-AP1干扰质粒、过表达质粒和慢病毒辅助质粒。使用MISSION Lentiviral Packaging Mix kit （Sigma）按操作步骤将重组质粒、包装载体pGag/Pol、pRev和封装载体pVSV-G共转染至HEK293T。将CDK2-AP1慢病毒按感染复数（MOI）为20，感染6孔板中SK-BR-3细胞获得稳定过表达；同样siCDK2-AP1慢病毒感染MCF-7获得稳定沉默。感染96h后抽提细胞总RNA和蛋白。（3） Realtime RT-PCR：CDK2-AP1扩增引物见上述，内对照GAPDH引物为5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'和5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。两步法行实时荧光定量，40个循环中每次在延伸阶段读取吸光度值；PCR结束后，95℃变性lmin，冷却至55℃，从55℃开始升温至95℃，每一步保持在＜30s上升0.5℃，同时读取吸光度值，绘制熔解曲线。（4）Western blot：取30μg等量蛋白加至12% SDS-PAGE凝胶电泳，冰浴、90V恒压条件下电转120min。转好的膜加一抗4℃孵育12h，洗膜3次，用封闭液稀释相应的辣根过氧化物酶共价二抗室温孵育2h，TBST洗膜3次。ECL Western试剂盒（Amersham）显色。（5）MTT assay：转染后乳腺癌细胞培养3d后1×103/孔接种于96孔板，44h后加MTT溶液（5mg/ml）37℃培育4h，弃培养介质，每孔加100μl DMSO室温振荡使充分溶解，检测540nm波长处吸光度值绘制细胞生长曲线。（6）克隆形成实验：转染后乳腺癌细胞对数生长期胰酶消化、完全培养基重悬。800个/孔接种于6孔板，继续培养至每个克隆包含＞50个细胞。PBS洗涤细胞2次，多聚甲醛固定后PBS洗涤2次，Giemsa染色，去离子水洗涤3次后计数克隆。（7）细胞周期：转染后乳腺癌细胞1×106/孔接种于12孔板，培养24h后胰酶消化、收集细胞，1500r/min离心5min；1ml预冷PBS洗涤细胞1次，转移至1.5ml离心管，4℃、1500r/min离心5min，50μl预冷PBS重悬并吹散成单细胞悬液，逐滴加入预冷的950μl 70%乙醇中置-20℃ 3h。加入1U DNase-free RNase，37℃孵育30min，1500r/min离心5min，弃上清液，每管加入500μl PI染色液，37℃避光孵育1h，流式细胞仪检测细胞周期分布。（8）裸鼠成瘤实验：CDK2-AP1过表达的SK-BR-3细胞和CDK2-AP1干扰后MCF-7细胞培养至对数生长期，胰酶消化、PBS重悬，100μl细胞悬液（1×107/mouse）皮下注射于雌性裸鼠（BALB/c-nu/nu）［n=54，（20±2）g，4～5周龄］。每3d测量肿瘤大小，记录长径和垂直短径，以公式V （mm3）=1/2ab2计算体积。5周后处死裸鼠，取瘤称重。肿瘤组织切片免疫组化检测CDK2/ CyclinD1并计算bcl-2/bax比值。

1.3统计学分析 CDK2-AP1表达差异通过卡方检验分析、肿瘤体积和重量差异运用重复测量数据的线性回归分析检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1CDK2-AP1蛋白表达在正常乳腺组织高于乳腺癌组织 免疫组化染色结果显示CDK2-AP1阳性表达率在正常乳腺组织（72.5%）、导管原位癌（16.7%）、侵袭性乳腺癌（14.0%）、复发转移性乳腺癌（5.6%）依次降低（P＜0.001）；CDK2及CyclinD1在正常乳腺组织（7.5%、12.5%）、乳腺导管原位癌（40.0%、50.0%）、侵袭性乳腺癌（51.2%、55.4%）、复发转移性乳腺癌（55.6%、50.0%）的表达依次升高（P＜0.001）。不同组织中CDK2-AP1的表达差异提示正常乳腺到癌变以至发生侵袭、转移的过程中CDK2-AP1表达降低、功能受抑制并与CDK2/CyclinD1反相关。

2.2CDK2-AP1mRNA可在MCF-7细胞成功沉默、在SK-BR-3细胞成功过表达 MCF-7细胞内源性CDK2-AP1的mRNA和蛋白表达水平均较高，SKBR-3细胞则均较低；MDA-MB-231则是mRNA水平较高而蛋白偏低。故以慢病毒介导的CDK2-AP1 siRNA静默MCF-7细胞的CDK2-AP1表达（见图1），转染过表达CDK2-AP1mRNA于SK-BR-3细胞（见图2）。

2.3CDK2-AP1抑制乳腺癌细胞生长、阻滞细胞于G0/ G1和G2/M期 MTT和克隆形成实验均显示CDK2-AP1mRNA静默的MCF-7细胞生长加速而过表达CDK2-AP1mRNA的SK-BR-3细胞生长受抑制；过表达CDK2-AP1的SK-BR-3细胞G0/G1及G2/M期比例增多、S期比例降低（P＜0.05），siCDK2-AP1转染的MCF-7 G0/G1及G2/M期比例降低、S期比例升高（见图3）。

2.4CDK2-AP1静默促进MCF-7细胞在裸鼠成瘤和生长 siCDK2-AP1转染MCF-7细胞及对照细胞分别皮下注射于裸鼠，生长5周，发现CDK2-AP1干扰后促进MCF-7细胞在裸鼠成瘤且生长迅速，肿瘤体积及质量均大于对照组（见图4A、B）。免疫组化显示CDK2-AP1抑制后bcl 2/bax比值升高，CDK2/ cyclinD1表达升高（见图4C）。

图1　CDK2-AP1 mRNA及蛋白在三种乳腺癌细胞系的表达情况

图2　通过慢病毒载体转染使CDK2-AP1在MCF-7细胞静默、在SK-BR-3细胞过表达。 A CDK2-AP1 siRNA慢病毒转染MCF-7及CDK2-AP1过表达慢病毒转染SK-BR-3细胞。B MCF-7转染CDK2-AP1 RNAi后mRNA降低80.1%。C CDK2-AP1mRNA过表达于SK-BR-3，内源性CDK2-AP1mRNA上升3.3倍。D MCF-7转染后CDK2-AP1蛋白水平降低77.7%。E SK-BR-3转染后CDK2-AP1蛋白水平上调。

图3　CDK2-AP1抑制乳腺癌细胞生长，阻滞乳腺癌细胞于G0/G1及G2/M期，并提高乳腺癌细胞对多烯紫杉醇的化疗敏感性。A 干扰后MCF-7细胞克隆形成数是对照组两倍，过表达后SK-BR-3克隆数减少。 B 干扰CDK2-AP1后MCF-7细胞增殖加速至对照组1.31倍。C CDK2-AP1过表达抑制SK-BR-3细胞增殖。D 过表达CDK2-AP1阻滞SK-BR-3细胞于G0/G1、G2/M 期，下调CDK2-AP1促进MCF-7细胞进入S期。

图4　CDK2-AP1降低/缺失促进MCF-7细胞裸鼠成瘤、增殖，抑制凋亡。

3　讨论

已知CDK2在细胞周期调控中起着关键作用，正常细胞的新陈代谢有赖于CDK2上、下游的调控，包括CDK2-AP1对CDK2的灭活及增殖细胞的凋亡。失去CDK2-AP1的调节，CDK2过表达会导致细胞周期下游信号通路激活、细胞持续增殖，形成细胞恶变的基础；而在肿瘤细胞则可能导致其生物学行为的改变比如增殖、侵袭力增强。作者通过临床标本检测发现在乳腺癌存在CDK2-AP1表达降低/缺失而CDK2/ CyclinD1表达升高的情况，CDK2-AP1在正常乳腺组织细胞表达远高于乳腺癌组织。此结果提示CDK2-AP1与乳腺癌的发生发展存在密切的联系：CDK2-AP1表达降低以至缺失导致乳腺细胞进入恶性增殖形成肿瘤，缺乏细胞周期调控的乳腺癌细胞增殖及侵袭能力增强。

通过CDK2-AP1细胞功能实验，证实抑制CDK2-AP1表达后乳腺癌细胞周期后移、增殖加快；过表达CDK2-AP1的乳腺癌细胞的细胞周期阻滞在G0/G1和G2/M期，增殖受抑制。同时CDK2/CyclinD1的表达与CDK2-AP1具有明显的负相关性，提示以CDK2-AP1/CDK2/CyclinD1为核心的细胞周期信号通路在乳腺癌细胞具有重要作用，影响乳腺癌细胞的发生和进展。动物实验进一步证实这一推测，接种CDK2-AP1干扰的乳腺癌细胞在裸鼠易于成瘤且生长迅速，显著高于对照组；在裸鼠肿瘤组织通过免疫组化检测发现CDK2/CyclinD1的表达升高，bcl-2/ bax比值升高。结果表明CDK2-AP1/CDK2/CyclinD1对动物体内乳腺癌细胞的生长调控具有重要作用，CDK2-AP1降低/缺失会导致细胞周期路径重要调控因子CDK2/CyclinD1的持续活化，且可能因失去对bcl-2的抑制而导致bcl2/ bax比值升高、细胞凋亡减少。以上证据提示在动物体内CDK2-AP1表达降低或缺失会促进肿瘤发生及进展，而且为细胞周期路径的调控作用提供了依据。

本资料提示CDK2-AP1可以抑制乳腺上皮细胞恶性分化及增殖，其表达降低/缺失促进乳腺癌的发生及进展。CDK2-AP1具有成为乳腺癌治疗手段的潜在可能性。

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Objective To observe the role of CDK2-AP1 in breast cancer. Methods Expressions of CDK2-AP1，CDK2 and CyclinD1 were examined in 209 cases of pathological specimens using IHC staining. Lost-of-function and Gain-of-function assays were performed in vivo and in vitro to assess the specifi c role of CDK2-AP1 in breast cancer. Results The positive ratio of CDK2-AP1 expression was reduced successively in normal breast tissue，DCIS，invasive breast cancer and relapsed breast cancer，suggesting that CDK2-AP1 was correlated closely with the tumor's genesis and progress and might work as a tumor suppressor. After down-regulating CDK2-AP1 in breast cancer cells，the cell cycle was accelerated and the cell proliferation was promoted. The cell cycle was arrested in G0/G1 phase and G2/M phase after up-regulating CDK2-AP1 in breast cancer cells，resulting in inhibited cell proliferation. The same results were obtained by animal assays. Conclusions CDK2-AP1 affects tumor genesis and tumor growth by cell cycle regulation，which has the potential to be a therapeutic agent in breast cancer.

CDK2-AP1 Breast cancer Cell cycle

浙江省卫生厅青年人才基金（2010QNA005）；浙江省自然科学基金（Y2110519）

浙江省肿瘤医院乳腺外科（何向明 俞洋 杨红健）上海交通大学附属上海第六人民医院乳腺外科（黄润宗祥云）浙江大学附属第一人民医院病理科（向华）