两种方法定量检测HBV异常血清标志物与血清HBV DNA水平的关系

黄粱镔　张雄　龙欣　赵晓玲 　田应敏

两种方法定量检测HBV异常血清标志物与血清HBV DNA水平的关系

黄粱镔张雄★龙欣赵晓玲 田应敏

目的 对经确认的血清乙肝表面抗原（HBsAg）高值患者，测定其血清乙型肝炎病毒（HBV）-DNA结果，探讨两者间的关系，为个体化诊疗提供更好的依据。方法 2013年共用时间分辨荧光免疫（TRFIA）法初步检查HBV-M标本9140例，阳性数值较高的患者175例，再采用微粒子化学发光免疫法（MEIA）进行定量复检及运用FQ-PCR进行HBV-DNA检测。 统计2次定量结果及HBV-DNA检测含量分布并与HBsAg含量比对分析。结果 运用TRFIA法及MEIA法检测结果之间差异不明显，定量分析结果与HBV-DNA之间，HBsAg＞100且HBV-DNA＞4.0的比例为58.8%，3.0～4.0比例为17.6%，＜3.0为17.6%。HBsAg＞100且HBV-DNA＞4.0的比例为19.4%，3.0～4.0比例为6.9%，＜3.0为73.6%。HBsAg＞100且HBV-DNA＞4.0的比例为27.2%，3.0～4.0比例为5.7%，＜3.0为67.1%。结论 定量方法检测HBsAg，是对FQ-PCR法的有益补充，与FQ-PCR法测定HBV- DNA含量相结合，能更全面地掌握患者乙肝病毒复制程度及病毒蛋白合成水平，能为个体化治疗提供更加科学可靠的依据。

中华医学会肝病学分会和感染病学分会于2012年对《慢性乙型肝炎防治指南》进行更新［1］。以规范慢性乙型病毒性肝炎（简称乙肝）的预防、诊断和治疗。乙肝诊治时最重要的指标是血清学标志物与HBVDNA，HBV血清学检测可用定量的方法进行，另外HBV DNA定量检测可反映病毒复制水平。本资料对本院2013年以来，通过HBV-M定量检测后结果异常的标本进行复查，同时对HBV-DNA检测的结果进行回顾性分析，报道如下。

1　临床资料

1.1一般资料 收集2013年1月至12月本院门诊和感染科患者初次定量检测HBsAg 9140例，阳性数值较高的患者175例，男85例，女90例；年龄9～83岁，平均43.7岁。当天的HBV标本定量检测完成后，将血清标本保存于-20°冰箱，再采用另外的方法进行定量及HBV-DNA检测。

1.2方法 （1）HBV血清学定量检测：①HBV血清学常规定量检测：方法为时间分辨免疫荧光分析法（TRFIA法），采用上海新波生物技术有限公司生产的Anytest-2000型 时间分辨荧光分析仪及其配套试剂（HBsAg批号：8600010214-8600011791）。测定前用试剂盒内配套乙型肝炎线性参比品制定标准曲线，并由Anytest 2003中文软件得出其各标准曲线，皆符合工作要求。②HBV血清学复检定量：采用微粒子化学发光法，采用美国ABBOTY（雅培）公司生产的Abbott ARCHITECT i2000SR 免疫分析仪及其配套试剂（HBsAg）。质控品批号：31568LF00。（2）HBV-DNA定量分析：①仪器试剂：HBV-DNA核酸定量检测试剂盒为广州达安公司产品，台式高速微量离心机，上海SLAN荧光定量PCR扩增仪，生物安全柜等。②血HBV-DNA定量检测：采用PCR荧光探针法检测HBV DNA病毒水平；待测标本和质控标本一起处理，质控标本包括阴性对照、低值质控和高值质控，质控品由北京康彻期坦公司出品标准物质；采用煮沸裂解法从100μl血清中提取HBV DNA，终体积为10μl；取上清液2μl为扩增模板，扩增体系为2μl模板和38μl荧光PCR试剂。用SLAN FQ-PCR仪扩增，条件为93℃ 2min；93℃ 45S，55℃ 60s 10个循环至 93℃30s，55℃ 45s 40个循环。扩增后，参照试剂盒说明书设定结果分析条件参数（阈值和基线）；通过标准曲线得到待测标本DNA浓度。试剂盒最低检出限为1.0×102IU/mL。

1.3统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以（±s）表示，行t检验，计数资料以例数表示，行χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1常规定量检测结果 见表1。

表1　2013年TRFIA法检测HBsAg结果含量分布（±s）

表1　2013年TRFIA法检测HBsAg结果含量分布（±s）

注：0.2是厂家推荐的临界阳性值

HBsAg浓度分组（μg/ml）n各阳性组HBsAg浓度（μg/ml）＜0.28963 0.2～1093.43±1.45 11～1002050.53±30.95＞100146209.95±33.3

2.2复检定量检测结果 见表2。

表2　2013年CLIA法对异常HBsAg复检结果含量分布（±s）

表2　2013年CLIA法对异常HBsAg复检结果含量分布（±s）

注：0.5是厂家推荐的临界阳性值

HBsAg浓度分组（IU/ml）n各组HBsAg浓度（IU/ml）0.05～1074.98±3.78 11～1001948.78±26.59＞100149219.84±22.49

2.3HBV-DNA检测结果 见表3。

表3　不同含量HBsAg定量结果与HBV-DNA水平构成分析

3　讨论

临床上自2000年以来，逐渐开始使用粒子酶免分析法（MEIA）、化学或电化学发光法等检测HBV血清标志物。MEIA因具有极高的灵敏度、特异度和稳定性等特点而得到肯定［2］。TRFIA是一种新的高灵敏的检测方法。以其灵敏度高、操作简便、易自动化、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光的干扰、标记物制备简便且稳定、无放射性污染、多标记等特点，近年来在医院内应用较多。

乙型肝炎治疗时，血清HBV DNA水平是目前临床上评价HBV复制情况的“金标准”，且对非活动性HBsAg携带状态的判定有重要意义。而HBV DNA水平则是对治疗方案进行优化和调整的重要依据［3］，一旦开始治疗，则应每3～6个月检测1次血清HBV-DNA水平，同时检测ALT、HBeAg和HBeAb水平［4］。未提出同时检测HBsAg，结合本资料结果，HBsAg＞100且eAg阳性的标本中，＜3.0占17.6%，eAb阳性的标本中，＜3.0占73.6%。分析原因如下：（1）乙肝的自然病程的四个分期中，表面抗原基本上不会消失，而每年约1%非活动性HBsAg携带者可自发性清除HBsAg，临床治疗的目标是发生eAg-eAb的血清学转换以及实验室检测不到HBV-DNA［5］。（2）HBsAg含量与HBV- DNA含量间不平行，HBsAg浓度高的标本，HBV-DNA并不一定高，可能与人群对乙肝病毒特异性免疫应答水平存在极大的个体差异，不同的感染方式和年龄有不同的自然过程，机体对乙肝病毒的免疫应答水平随年龄、遗传因素不同而差异较大，导致在免疫清除期时个体的HBsAg与HBV-DNA结果不平行。（3）在非活动期时，多数患者发生血清学转换后，仍有低水平的HBV复制，表现为HBsAg阳性，而HBV-DNA检测不到或较低［6］。（4）使用抗病毒药物或患者处在免疫清除阶段时，血清中病毒抗原与HBV DNA水平的变化速度是不一致的，后者清除速度较快，而当血清HBV DNA降至检测水平以下时，肝内仍可有HBV复制［7］。（5）操作方法的原因：尽管越来越多实验室通过卫生部PCR实验室认可，但是在方法学上多数实验室达不到核酸标本的自动提取和纯化水平，厂家提供的标准品多数是核苷合成物，而非血清基质，为保证曲线的相关性，标准品不需要和标本一样的扩增步骤。试剂本身达不到国际主流的适合自动化操作的磁珠法要求，同时亦降低了结果的灵敏度和准确度［4］。

综上所述，作者认为，TRIFA法测定乙肝病毒标志物，是对FQ-PCR法的有益补充，有助于了解患者病毒抗原的合成与释放水平，协助判断患者肝细胞内病毒复制程度，观察HBsAg含量的变化，一定要与FQ-PCR法测定HBV DNA含量相结合，才能更全面地掌握患者乙肝病毒复制程度及病毒蛋白合成水平，能为个体化治疗提供更加科学可靠的依据。有助于判定治疗终点或调整治疗方案。

1 中华医学会肝病学分会,中华医学感染病学会.慢性乙型肝炎防治指南.实用肝脏病杂志,2006, 9（1）：1`16.

2 颜永乾.时间分辨荧光免疫分析测定乙型肝炎病毒表面抗原Cutoff值的确定.国际检验医学杂志2013,34（10）：1276.

3 Chan HL,Wong VW,Tse AM,et al.Serum hepatitis B surface antigen quantitation can reflect hepatitis B virus in the liver and predict treatment response.Clin Gastroenterol Hepatol,2007,46：S186.

4 蒋素贞,鲁凤民,庄辉.慢性乙型肝炎病毒DNA定量检测的临床意义.中华检验医学杂志,2012, 35（2）：117.

5 张欣欣,Stephen A,Locamin.HBsAg定量检测在慢性乙型肝炎抗病毒治疗监测中的意义. 中华检验医学杂志,2010,33（1）：82～83.

6 Hui CK, Cheung WW, Au WY, et al. Hepatitis B reactivation after withdrawal of preemptive lamivudine in patients with haematological malignancy on completion of cytotoxic chemotherapy.Gut,2005,54（11）：1597～1603.

7 田沂,唐晓鹏,杨旭,等.HBV标志物定量与病毒裁量关系探讨.第三军医大学学报.2007,29（13）：1306.

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