牛乳制品中青霉素酶Alphalisa的检测方法

王坤

【摘要】牛奶制品中的青霉素酶是奶制品的安全风险物之一。由于青霉素的价格低廉，疗效确切，经常被用来治疗奶牛乳腺炎，然而，青霉素的滥用导致牛乳中的青霉素残留已经成为广大消费者关注的重点。青霉素酶属于β-内酰胺酶，可水解青霉素类的β-内酰环，使青霉素水解为青霉噻唑酸。青霉噻唑酸可与T细胞表面组织相容性复合物（MHC）或与镶嵌在细胞内的多肽结合，所形成的复合物激发T细胞，从而引起过敏反应。因此对于牛奶制品中青霉素酶进行检测具有重要的意义。

【关键词】牛乳制品；青霉素酶；Alphalisa检测方法

一、β-内酰胺酶检测方法及原理

现有的青霉素酶的检测方法有碘量法、酸度法、高效液相色谱法、酶联免疫法、头孢硝噻吩显色法以及杯碟法等。碘量法是《中国药典》中规定的检测β-内酰胺酶活性的方法，该法方便快捷、检出限高。现阶段，牛乳制品中β-内酰胺酶的检测方法采用的是卫生部制定的《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类物质检验方法杯碟法》，该方法可以检测出生鲜乳中未反应完全的β-内酰胺酶，可用于检测未经过任何加工的牛奶，并且检出限较低，容易区分外源性和内源性β-内酰胺酶。其检测原理是以一种对青霉素高度敏感的细菌作为指示菌，实验时如果被测牛奶样品含有青霉素酶，破坏了青霉素，指示菌株即可生长，否则指示菌将被抑制。同时，通过与标准品比对抑菌圈的大小，可以定量地确定β-内酰胺酶的含量。崔生輝等运用β-内酰胺酶特异性抑制剂舒巴坦建立了该酶的检测方法，该方法在牛奶中的检出限为4U/mL。目前，微生物法仍然是实验室检测牛奶中β-内酰胺酶的主要方法。

二、材料和方法

（一）材料和试剂

青霉素酶（P0389，sigma）；Zeba Spin 脱盐柱（89889，Thermo Scientific）；青霉素酶抗体（ab12251，Abcam）；青霉素酶（ab10712，Thermo Scientific）；Chroma Link? Biotin （B-1001-010， Solulink）；鸡抗鼠 IgG （ab6706，Abcam）；Alpha Screen? Streptavidin Donor beads（6760002，perkinelmer）；Alpha Screen? Unconjugated Acceptor Beads（6762001，perkinelmer）。

（二）方法

2.1抗原的纯化及生物素化

抗原的纯化：将青霉素酶溶解于修饰缓冲液（100mmol/L 磷酸钠，150mmol/L NaCl， pH8.0）中， 用Zeba Spin脱盐柱进行液体交换和脱盐净化。净化过程：取出低温保存的脱盐柱，回复室温，去掉脱盐柱底端封口帽，开盖，将柱子放入收集管中。4℃，1500r/min离心2min，去除保存液。向柱子中加入合适体积的待交换溶液，洗柱，4℃，1000r/min 离心2min，重复2～3次。将柱子放入新的收集管中，慢慢将适量的样品注入树脂的中心位置。5mL的柱子上样量为500～2000?L。4℃，1000r/min离心2min，收集样品。A280nm测定蛋白浓度，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），确定蛋白的相对分子质量。

青霉素酶的生物素化：用修饰缓冲液将蛋白质量浓度调整到1～2mg/mL。计算抗原和生物素化试剂的比例，取53?L脱盐后的抗原溶液加入4.6?L的Chromalink Biotin的二甲基甲酰胺溶液（取1mg Chromalink Biotin加入100?L无水二甲基甲酰胺中即成）中，室温条件下结合90min。同前进行脱盐，也交换缓冲体系为Alphalisa检测缓冲液（含25mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，0.5%聚乙二醇辛基苯基醚，0.1%干酪素，1mg/mL葡聚糖T500，pH7.4）中，分光光度计测定A280nm和A354nm的值，计算摩尔替换比率。

2.2受体磁珠偶联抗鼠IgG

取5～50?L（20mg/mL）的受体磁珠于1.5mL的离心管中，加入50?L的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4），14000r/min离心15min，去上清液。现配400mmol/L NaBH3CN溶液，然后按照每5?L受体磁珠和10?L抗小鼠IgG抗体（1mg/mL）、1?L NaBH3CN、0.125?L的10%吐温20以及3.875?L的HEPES Buffer 37℃轻柔振荡反应18～24h。然后加入10?L 65mg/mL的CMO溶液（用800mmol/L的NaOH溶液现配现用），37℃，轻柔振荡反应1h。然后4℃、14000r/min离心15min，去上清液，然后加入200?L的100 mmol/L Tirs-HCl（pH8.0）重悬磁珠。随即进行10次超声振荡（每次1s），4℃、14000r/min离心15min，去上清液。然后加入Tirs-HCl（pH8.0）溶液，同前进行第二次超声，离心，去上清液，加200?L的PBS（含0.05%的Proclin-300），涡旋振荡，同前简短超声，避光保存。

2.3Alphalisa检测

检测反应体系采用反向竞争模式，检测过程均在室温条件下完成，具体操作如下：取青霉素酶溶解于检测缓冲液中，然后取5?L该溶液和等体积的抗青霉素酶单克隆抗体反应1h，形成抗原抗体复合物；然后加入5?L生物素化青霉素酶反应0.5h，竞争结合游离的抗青霉素酶单抗；接着加入各5?L的抗鼠IgG包被受体磁珠工作液和链亲和素供体磁珠工作液，避光反应0.5h，最终形成供体磁珠-生物素化青霉素酶-抗青霉素酶单抗-受体磁珠复合物。最后，在ENspire multimode reader的Alphalisa检测模块中，以680nm波长处的入射光下发生荧光共振能力转移，单体氧传递到受体磁珠上，同步激发波长615nm的发射光，记录反应的信号值。

三、结论

青霉素酶的残留给乳制品的质量安全带来了极大的危害。将Alphalisa检测方法应用于青霉素酶的检测主要的挑战是基质样品的复杂性。在Mechaly等的实验结果表明Alphalisa法可以克服基质样本的复杂性。该研究将Alphalisa方法应用于环境样品中炭疽孢子的检测，灵敏度达到106孢子/m L。本研究的结果也表明，不同的牛乳制品对反应均有一定程度的抑制，但是通过离心、过滤的处理后，都能在一定的浓度范围内呈现良好的线性反应规律。由于Alphalisa检测反应一直处于均相的液体环境下反应，检测限低于常规的同类方法。由于没有洗板的过程，Alphalisa检测的时间大大缩短，比常规酶联免疫吸附方法缩短1～2 h。由此可见，Alphalisa方法在复杂样品中进行快速、高灵敏度的检测能力极强，有望成为常规酶联免疫吸附方法的替代方法。