一种大鼠心肌缺血模型的制作方法

吕沛然等

【摘要】目的：建立一种大鼠心肌缺血模型制作方法，保证模型制作的准确程度与术后大鼠存活率。方法：大鼠麻醉后，先行明视经口气管插管，呼吸机供给氧气；次行开胸结扎冠状动脉左前降支术；再行肺复张术；另术前及术后三天予以抗生素注射与体温支持等措施。结果：经过改进，造模准确率达到100%，术后四周存活率达到 80%。结论：控制结扎位置可提高模型准确率，术中供给氧气可提高大鼠存活率。

【关键词】心肌缺血；动物模型；大鼠；氧气；冠状动脉左前降支

【中图分类号】R-332；R542.22 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）02-0693-02

基金项目：国家自然科学基金（项目批准号：81373561）

在心肌缺血（MI）动物模型制作中，SD大鼠是常用动物[1]，行结扎冠状动脉左前降支（LAD）手术是传统造模方法。如何准确客观模拟心肌缺血的病理改变且提高大鼠术后存活率是模型制作的关键。本研究课题组立足于本实验室实际并参考众多研究者经验[2、3]，建立了一种大鼠心肌缺血模型的制作方法，以期达到保证模型成功率与大鼠术后存活率的目的。

1实验材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物

SD大鼠，20只，雌雄各半，2～4 月龄，体重250±30g，由四川省人民医院实验动物研究所中心提供（许可证号：SCXK（川）2013-15）。动物在手术操作前适应饲养一周，饲养环境为自然光暗周期，温度23～26℃、相对湿度40%～70%，雌雄分开，5只/笼，自由饮水进食。

1.1.2手术器械及耗材

显微持针钳，开睑器，7-0显微带线缝合针，4-0缝合线，○ 1/2 4×12医用逢合针，24G静脉留置针，铁丝，常规手术器械与耗材。

1.1.3药物

水合氯醛、0.9%氯化钠注射液，注射用青霉素钠，碘伏、75%乙醇，PBS磷酸盐缓冲液、TTC染色液。

1.1.4仪器设备

肯特Kent PhysioSuite （Monitor for Mice and Rats） ，氧气袋，CMA/450动物恒温控制器，BL-420S生物机能实验系统，自制鼠台，强光手电筒。

1.2实验方法

1.2.1麻醉

7%水合氯醛氯化钠溶液以280mg/kg（0.4ml/100g）比例对大鼠进行腹腔注射麻醉，再腹腔注射青霉素8万U预防感染，然后将其仰卧位固定于鼠台上，前胸部备皮，碘伏消毒。

1.2.2气管插管及呼吸机设置

采用明视经口气管插管的方法，并通过呼吸机供给医用氧气。

气管插管。将24G靜脉留置针剪去前端留约5 cm软管，插入细铁丝，医用棉签擦拭其口腔，术者一手向外上方提起大鼠舌头，另一手持留置针，助手持手电筒照射其颈部，术者经口腔观察到大鼠的声门襞随着呼吸节律开合，将留置针抵在气管口，当声门襞打开时顺势将留置针推入气管，手下有留置针向前推进时与环状软骨相碰撞的顿挫感，退出铁丝，置一丝棉絮留置针口，若其随呼吸被吹动可确定插管成功。

呼吸机设置。将留置针与肯特Kent PhysioSuite相连。其进气口连接氧气袋，供给氧气。根据大鼠体重设置相关呼吸辅助参数，仪器自动设置呼吸频率，范围在65～81次/分，手动设置潮气量，比例为1ml/100g体重，吸呼比1：1，叹息通气比为1：60。

1.2.3开胸手术及结扎

连接BL-420S生物机能实验系统，监测并记录手术过程中心电图的变化。开胸手术：雌鼠于左侧胸部第二与第三乳头间中上三分之一处，垂直前正中线剪开皮肤2～2.5 cm（雄鼠剪开皮肤位置参考对比雌鼠），常规钝性分离筋膜层与肌肉层，暴露肋层。于第三肋间靠近胸骨处，止血钳迅速穿破肋间肌，沿肋间横向分离肌肉约1～1.5 cm，放入开睑器，撑开第四肋间，充分暴露视野。

结扎LAD。撕破心包膜，暴露左心耳与肺动脉圆锥，可察及暗红色的为左冠状静脉主干，冠状动脉左前降支（LAD）与之紧密伴行。以左心耳、肺动脉圆锥与左冠状静脉主干为标志，在其下缘连线下方约2 mm处确定冠状动脉左前降支（LAD）位置，7-0显微带线缝合针垂直于左冠状静脉主干约2 mm进针，深度约1～1.5 mm，宽度约3～4 mm，于其冠状静脉主干另一侧约2mm处出针，结扎冠状动脉左前降支（LAD）。结扎后，肉眼可观察到结扎位置及以下冠状动脉左前降支供血区心肌变白，心电图中ST段抬高。

1.2.4关胸

撤下开睑器，缝合肋间。肋间缝合完毕后，术者在由两侧向中间挤压大鼠胸腔的同时，助手堵住呼吸机的出气口，约2～3 秒，助大鼠肺复张，刺激其自主呼吸，并恢复胸腔负压。常规缝合肌肉层与皮肤，可重复挤压胸腔的操作。

缝合完毕，观察大鼠的呼吸情况，若其自主呼吸明显，试停呼吸机，待到大鼠呼吸平稳即可撤下呼吸机。

1.2.5 术后护理

将大鼠以右侧卧位置于铺好干净垫料的鼠笼中，单笼饲养。

未苏醒时，要对大鼠进行保暖以防其体温过低死亡。术后约1.5～2h后，大鼠或有翻身挣扎，此时可用注射器向其口角滴饮用水，一般情况下大鼠就会主动饮水，既补充液体，又刺激其苏醒。术后连续3天每天腹腔注射青霉素8万U，每天更换垫料、供给饮用水与新鲜饲料。

2结果

2.1模型成功标准

造模成功与否可由结扎LAD后心电图的变化与心肌颜色的变化进行判定，还可以有一些手术后大鼠行为学的改变作为参考，并做心脏切片TTC染色加以确认。

2.1.1术中心肌颜色与心电图改变

结扎LAD后，可观察到结扎位置及以下心肌变白，提示结扎到位。

正常心电图、结扎后心电图如图1、图2，结扎后可明显观察到S-T段的改变[4]，提示结扎到冠状动脉左前降支，造模成功。

箭头所示，结扎后S-T段抬高。

2.1.2大鼠行为学改变

术后饲养时可观察到大鼠背毛乍起，常呈弓背体位[5]，且进水、饮食等活动减少。

2.1.3心肌TTC染色

术后第四周末，由股静脉注射适量10% KCL处死大鼠，打开胸腔迅速取出心脏，剪去多余组织，4℃生理盐水冲净瘀血，-20℃冷冻2小时后，由心尖向结扎位置垂直心脏长轴做2～3 mm切片，置于适量0.1%TTC溶液中37℃温育5min左右，结果如图3，结扎位置以下缺血区心肌为白色。

箭头所示，结扎位置及以下缺血区心肌染色结果为白色。

2.2 大鼠术后成活率

共计20只大鼠，4只术后撤下呼吸机后死亡，余16只成活至术后第四周末，成活率80%。

结论

一个稳定且可复制的动物模型是实验研究开展的基础，在大鼠心肌缺血模型的制作中有很多细节需要把握，经过反复的手术操作练习，才能保證模型的准确与稳定。

参考文献

[1]李峰杰，李贻奎.心肌梗死动物模型研究进展[J].中国药理学通报，2013，29（1）：5-10.

[2]王燕，陈光辉，尹作民，刘为生.大鼠心肌梗死动物模型的制备[J].中国比较医学杂志，2010，20（6）：54-57，90.

[3]刘开宇，田海，孙露，李大为，贾智博，蒋树林，李仁科.标准化大鼠心肌梗死模型的制作[J].哈尔滨医科大学学报，2007，41（6）：531-534.

[4]何涛.大鼠心肌梗死模型的病理与心电图变化研究 [D]广西医科大学

[5]. Degabriele Naomi M， Griesenbach Uta， Sato Kaori， Post Mark J， Zhu Jie， Williams John， Jeffery Peter K ， Geddes Duncan M， Alton Eric W F W. Critical appraisal of the mouse model of myocardial infarction [J] . Experimental physiology， 2004， 89 （4）：497-505.