HPLC法分析测定“黑美人”马铃薯中原花青素

杨晓辉，汪岭，蔡慧珍，逯莉莉

（宁夏医科大学公共卫生学院，宁夏银川750004）

HPLC法分析测定“黑美人”马铃薯中原花青素

杨晓辉，汪岭，蔡慧珍，逯莉莉

（宁夏医科大学公共卫生学院，宁夏银川750004）

建立高效液相色谱法分离测定“黑美人”马铃薯中原花青素含量的分析方法。实验采用C18柱（Phenomenex 5 μm；250 mm×4.6 mm）；V（甲醇）∶V（0.5%冰醋酸水溶液）=30∶70为流动相；柱温：25℃；流速：1 mL/min；检测波长：287 nm。结果表明：原花青素在80 μg/mL～200 μg/mL浓度范围内有良好的线性关系，相关系数R=0.995 7，方法的精密度RSD为2.86%，平均回收率为100.1%，原花青素的平均含量为51.805 mg/g。本方法简便、快速、准确、可靠，可用于“黑美人”马铃薯中原花青素的含量的测定。

HPLC；“黑美人”马铃薯；原花青素

原花青素（Proanthocyanidins，简称PC）是广泛存在于植物界和食品中的一大类多酚化合物［1］，是近年来不断研究开发的一种较强的体内活性功能因子。据资料报道［2-6］，PC拥有强有力的抗氧化，清除自由基以及改善体循环的特殊功效，并能预防80多种因自由基而引起的疾病，包括心血管疾病、抗肿瘤、抗辐射、防血小板凝结的作用，其在人体内的抗氧化和清除自由基的能力是VE的50倍、VC的20倍。

PC来源广泛，毒副作用低，遂成为具有广阔发展前景的天然色素［7］。目前，PC已作为主要活性成分用于药品及食品营养补充剂中，尤其是其中一些聚合程度较低的PC（简称OPC）已经实现了较充分的商业开发和应用。目前大多数研究报道中都是利用甘蔗、葡萄皮、葡萄籽、蚕豆皮等提取PC的［2，5，8］，而且PC的提取方法已较为成熟。然而，由于PC组成和结构的复杂性，其测定方法还无统一标准，因而在相关产品中含量的准确表征始终是困扰市场的一个技术难题。

宁夏新大地黑土豆发展专业合作社所引进的“黑美人”马铃薯是利用航天技术育种研发出马铃薯家族中的新品种。“黑美人”马铃薯外形与普通马铃薯无异，但果皮呈黑紫色，富有光泽，最为奇特的是其果肉为深紫色，颜色诱人。据资料报道，“黑美人”马铃薯是一种集食用、药用、保健于一体的特殊薯类新品种，其内富含原花青素，营养价值更高，但其中原花青素的提取与测定方法文献较少报道。本文以乙醇为提取剂，超声波震荡提取“黑美人”马铃薯中的PC，并利用HPLC法分离、鉴定并测定其含量，旨在确定快速、准确、可靠的分离分析“黑美人”马铃薯中PC的方法，同时为更好的开发和综合利用“黑美人”马铃薯资源和开发新品种的天然色素提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料、仪器与试剂

“黑美人”马铃薯（购自宁夏新大地黑土豆发展专业合作社）；PC标准品（北京上立方联合化工技术研究院）；甲醇（色谱纯）；无水乙醇（分析纯）；冰醋酸（分析纯）；超纯水。

1.2仪器与设备

L-2000型高效液相色谱仪：日立公司；AL-204梅特勒分析天平：瑞士梅特勒；JYL-C012九阳料理机：九阳股份有限公司；KQ 3200DA型数控超声波清洗器：昆山市仪器厂；HP-01无油真空泵：天津市瑞森特仪器仪表商行；Neofuge 15R型高速冷冻离心机：上海力申科学仪器有限公司；Heal Force超纯水净化仪：力新仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1标准溶液的配制

准确称取干燥的PC标准品10.00 mg，用色谱纯甲醇溶解后，准确定容至50 mL，摇匀，制得浓度为200 μg/mL的PC标准应用液。分别精密移取上述标准应用液4、5、6、7.5、10 mL至10 mL容量瓶中，用色谱纯甲醇准确定容至刻度，得到浓度分别为80、100、120、150、200 μg/mL的PC标准系列溶液。

1.3.2样品的预处理

将“黑美人”马铃薯清洗干净后，晾干，用榨汁机榨汁（在榨汁过程中不加入任何溶液）成匀浆后，分别准确称取10.0 g于6个烧杯中，按料液比1∶7.5加入75%的乙醇，在超声振荡器（功率为80%）中于60℃提取30 min。最后，将各烧杯中提取后的溶液在离心沉淀机上以1 000 r/min～3 000 r/min递增的速度离心5 min，各取其上清液1 mL，用色谱纯甲醇稀释后，即得供试品溶液，待测。

1.3.3色谱条件

色谱柱：C18柱（Phenomene×5 μm；250 mm× 4.6 mm）；柱温：25℃；流动相：V（甲醇）∶V（0.5%冰醋酸水溶液）=30∶70；检测波长：287 nm；进样量：20 μL；流速：1 mL/min。

2结果与分析

2.1流动相的选择

取1.3.1和1.3.2中制备好的标准溶液及供试品试液用0.45 μm的微孔滤膜过滤后进样，流动相的变化对“黑美人”马铃薯中PC的分离效果影响很大。实验中参照相关文献［9-10］，分别尝试用甲醇-水（10∶90）、甲醇-水（20∶80）、甲醇-0.5%冰醋酸水溶液（20∶80）、甲醇-0.5%冰醋酸水溶液（30∶70）、甲醇-0.5%冰醋酸水溶液（25∶75）作为流动相，根据分离情况，最后选定甲醇-0.5%冰醋酸水溶液（30∶70）为流动相，结果如图1所示。

图1　PC标准溶液（A）及供试品（B）色谱图Fig.1HPLC chromatograms of PC reference substance（A），and sample extract（B）

由图1可知，此条件下“黑美人”马铃薯中PC与其他成分能很好的分离，且基线平稳。采用此色谱条件测定“黑美人”马铃薯中PC的含量，结果较为满意。

2.2标准曲线和回归方程

绘制标准系列溶液的峰面积-浓度标准曲线，如图2所示。

图2　PC标准曲线Fig.2The standard curve of PC

结果表明，所测PC在80 μg/mL～200 μg/mL浓度范围内有良好的线性关系，符合比尔定律，其回归方程为A=59 742.52+2 098.49C，R=0.995 7。

2.3方法的精密度

按照1.3.2进行样品提取处理，在1.3.3色谱条件下进样，测定PC组分峰的峰面积，此法平行做6次，测定结果见表1，6次测定的RSD=2.86%，说明本方法的精密度良好。

表1　方法的精密度实验（n=6）Table 1Precision test of the method（n=6）

2.4样品的加标回收率

取1号、5号供试品做加标回收率实验：平行取3份1 mL供试品，分别加入20、30、50 μL PC标准溶液（200 μg/mL），测定其含量并计算回收率，结果见表2。

表2　样品加标回收率（n=3）Table 2The results of recovery test（n=3）

由表2可见，平均回收率在92.3%～108.9%之间，平均回收率为100.1%，符合分析方法要求。

2.5测定结果

在上述同样条件下测定“黑美人”马铃薯中PC的含量，平行做6次，取平均值。测定结果如表3所示。

表3　“黑美人”马铃薯中PC含量（mg/g）Table 3Content of PC in“hei mei ren”potatoes（mg/g）

由表3可知，此方法下测得“黑美人”马铃薯中PC的平均含量为51.805 mg/g，较文献所报道的其他类物质中PC含量为高［9-10］，由于PC丰富的生理功效，“黑美人”马铃薯中PC适合于作为食品色素，可广泛应用于食品、化妆品、保健品等领域，值得进一步研究。

3结论

本实验采用HPLC法分离鉴定“黑美人”马铃薯中PC并测定其含量，所选用的色谱分析条件可使“黑美人”马铃薯中PC与其他成分很好的分离，该方法线性关系、精密度、重现性均良好，所测样品的平均回收率为100.1%，“黑美人”马铃薯中PC含量为51.805 mg/g。测定结果表明，该方法可行，专属性好，杂质干扰小，可用于“黑美人”马铃薯中PC的分离、鉴定及含量的测定。

［1］北京医学院，北京中医学院.中草药成分化学［M］.北京：人民卫生出版社，1980：115

［2］涂斌，李新莹，姚舜，等.甘蔗中原花青素含量的分析方法［J］.食品研究与开发，2009，30（6）：130-133

［3］吕丽爽.天然抗氧化剂低聚原花青素的研究进展［J］.食品科学，2002，23（2）：147-150

［4］凌志群，张晓辉，谢笔钧.原花青素的药理学研究进展［J］.中国药理学通报，2002，18（1）：9-12

［5］洪新，唐克，赵立松.葡萄籽中原花青素提取条件研究［J］.粮油食品科技.2009，17（4）：74-76

［6］余莹，粟武，魏东芝.原花青素体外清除自由基活性的研究［J］.华东理工大学学报，2002，28（3）：318-320

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［8］邓莉，褚仕超，刘章武，等.蚕豆皮中低聚原花青素结构的初步鉴定［J］.中国酿造，2013，32（2）：137-143

［9］刁海鹏，孙体健，姬小蕾，等.高效液相法测定爬山虎红色素中原花青素含量［J］.现代食品科技，2009，25（5）：566-567

［10］王建明，李早慧.高效液相法测定视力健咀嚼片中原花青素的含量［J］.中国医药导刊，2012，14（1）：167-168

Analysis and Determination of Proanthocyanidins in“Heimeiren”Potatoes by HPLC

YANG Xiao-hui，WANG Ling，CAI Hui-zhen，LU Li-li
（College of Public Health，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，Ningxia，China）

Proanthocyanidins in“Heimeiren”Potatoes was determined by HPLC.Phenomenex C18 column（5 μm；250 mm×4.6 mm）was used with the mobile phase of 30%methanol and 70%water（with 0.5%acetic acid）.The column temperature，flow rate and detection wavelength were 25℃，1 mL/min and 287 nm，respectively.The results showed that there was a good linear relationship between peak area and proanthocyanidins content within the range of 80 μg/mL-200 μg/mL.Linear correlation was 0.995 7，RSD of precision was 2.86%，the average recovery rate was 100.1%and the average content of proanthocyanidins was 51.805 mg/g.This method is simple，fast，accurate and reliable，suitable for determination of proanthocyanidins content in“Heimeiren”Potatoes.

HPLC；“Heimeiren”potatoes；proanthocyanidins

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.11.028

2013-12-06

宁夏医科大学面上项目（XM2012015）

杨晓辉（1979—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：分析化学和卫生检验。