酸敏改性葡聚糖的制备和载药研究

刘文雅， 郝瑶瑶， 胡慧阳， 陈维聪， 戴 箭*

（中山大学 工学院，广东 广州 510006）

近几十年来，肿瘤化疗发展成为癌症治疗的主要途径之一，但多数抗癌药物（如紫杉醇）的水溶性较差，而能溶于水的抗癌药物（如质子化阿霉素等）也普遍存在血液半衰期过短、对健康组织及细胞毒副作用大等问题[1-2]。因此，发展用于抗癌药物高效传输的药物载体具有重要的意义[3-4]。

本文以可生物降解的亲水性天然葡聚糖为反应底物，通过缩醛化反应制备两亲性的缩醛化葡聚糖，再利用乳化法制备出载药缩醛化葡聚糖纳米粒子。核磁共振、傅里叶红外等理化表征手段表征了缩醛化葡聚糖，研究了其在酸性条件下水解释放运载的药物的性能。本文以期解决化疗药物溶解性低的问题，利用肿瘤细胞内独特的微酸环境释放药物[5]，作为药物载体具有其独特的优势。

1 实验

1.1 原料与仪器

葡聚糖（分子量5000道尔顿，纯度98%，阿拉丁），将一定量的葡聚糖溶解在纯水中，并在－86℃冰箱中冷冻12 h后，放置到冷冻干燥机中冻干除水。冻干后的葡聚糖呈白色棉絮状，备用。2-甲氧基丙烯购置于西格玛奥德里奇（Sigma Aldrich，进口药品，分析纯）；吡啶对甲苯磺酸（分析纯）购置于阿法埃萨（天津）化学有限公司。二甲基亚砜、三乙胺、氯仿，均购置于广州市化学试剂厂。NMR溶剂：重水（D2O）、氘代DMSO（DMSO-d6）、氘代氯仿（CDCl3）、氘代盐酸，均购买于阿达玛斯。所用纯水为实验室配置的Millopore公司Milli-Q Century超纯水体系Millipak-40（MPGl 04S K2）设备纯化制得。

核磁共振光谱仪（400 MHz, Avance Ⅲ, Bruker），纳米粒度仪及Zeta电位分析仪（Zetasizer Nano ZS90,Malvern），冷冻干燥机（4.5 L Freeze Dry System, Labconco），高速离心机（Sorvall Stratos, Thermo），手套箱（Mbraun MB-Labstar, 德国），傅里叶变换红外光谱仪（VERTEX 70, Bruker Optik GMBH），恒温磁力加热搅拌器（IKA RCT basic），电子天平（BSA 224S-CW），超声波细胞破碎仪（S-4000, 美国sonicator）。

1.2 缩醛化葡聚糖的合成

对反应瓶进行无水无氧处理，而后将0.5 g的葡聚糖溶于10 mL的DMSO溶液中，在氮气保护下依次加入吡啶对甲苯磺酸0.042 g，0.055 eq（“eq”为相对于葡聚糖结构单元摩尔数的比例，下同）和2-甲氧基丙烯（1.765 mL，6.2 eq），室温下搅拌反应一段时间，加入三乙胺终止反应，所的产物沉于pH＝8.0的纯水中并静置一段时间，而后离心，涡旋，收集沉淀冻干即得产物，通过核磁计算分子量及反应程度[6-7]。

1.3 理化表征

核磁共振氢谱（1H-NMR）：取4～5 mg样品，溶于0.55 mL的氘代试剂中，装入核磁管，用Bruker AvanceⅢ（400 Hz）核磁共振波谱仪测定，MestReNova软件处理数据。

傅里叶转变红外光谱（FT-IR）：采用KBr压片的方法进行表征，用Origin8.0处理数据。

聚合物纳米载体负载疏水性药物的制备：将缩醛化葡聚糖（10 mg）和盐酸阿霉素（1 mg）分别用0.3 mL的二氯甲烷和0.2 mL的氯仿溶解，而后向盐酸阿霉素的氯仿溶液中加入4 mL的三乙胺调节成疏水性阿霉素，将两者混合均匀。而后将混合体系在探头超声条件下逐滴加入至4 mL磷酸盐缓冲溶液PBS（聚乙烯醇PVA，3% w/w）中，形成油/水（O/W）复合体系。转速10 000 r/min，离心15min，得到紫红色沉淀，用PBS溶液离心洗涤两次，除去过量的阿霉素，最后收集得到载药纳米粒子，将其溶于PBS溶液中，备用。

缩醛化葡聚糖的水解实验：称取20 mg的缩醛化葡聚糖，用1 mL的DMSO溶解，而后等体积分别缓慢滴加到pH＝5.0的醋酸缓冲溶液和pH＝7.4的PBS中，水浴超声2 min，放于室温下搅拌观察，拍照，记录反应现象。

粒径测定：样品缩醛化葡聚糖纳米粒子的粒径通过Malvirn电位粒度仪检测，取三次测量值作为最终结果。

缩醛化葡聚糖纳米粒子酸敏性释药行为的测定：取制备的载药纳米粒子PBS溶液（pH＝7.4），用荧光分光光度计检测载药纳米粒子中荧光药物阿霉素，将该测试溶液用0.01 mol/L的稀盐酸溶液调节成pH＝5.0，在酸性条件下用荧光分光光度计测定，10 min再次测定。

2 结果与讨论

本文引入一种酸敏感连接段―缩醛化结构作为功能基团，可对酸性环境作出响应。通过天然高分子葡聚糖的羟基与二甲氧基丙烯发生反应，形成缩醛化结构，其在碱性条件下稳定，在酸性条件下会水解成亲水段。缩醛化葡聚糖材料中缩醛结构为聚合物的疏水段，可用于包载疏水性药物，提高药物的生物利用度，此疏水段在酸性条件下迅速由疏水性变为亲水性，达到药物酸敏控释的效果。

2.1 酸敏感改性葡聚糖的制备和表征

缩醛化葡聚糖的合成路径如图1所示，用2-甲氧基丙烯作为缩醛化试剂，在吡啶对甲苯磺酸盐的催化作用下，对端炔基葡聚糖上的羟基进行缩醛化反应。将水溶性的葡聚糖转化为pH敏感的疏水性缩醛化葡聚糖。缩醛化反应的机理分为两步：第一步吡啶对甲苯磺酸活化2-甲氧基丙烯上的甲氧基，而后碳正离子与葡聚糖上的羟基发生亲核反应生成非成环结构，第二步吡啶对甲苯磺酸对非成环结构再次活化，形成稳定的五元环结构。所以在缩醛化反应的开始阶段大部分都为非成环结构，随着反应时间的延长，则会形成稳定的五元环结构如图1所示。由于五元环结构的稳定性及酸性水解机理，成环与非成环的醛基在酸性条件下水解存在差异，非成环部分水解比较快且形成等量的丙酮与甲醇，而成环部分水解较慢只有丙酮生成。缩醛化反应会破坏葡聚糖的羟基质子，但对葡聚糖上的C1并无影响，以核磁中葡聚糖上1号位的氢d ＝4.63 ppm为基准，通过积分面积计算可得到缩醛化反应的实际取代度。

图1 缩醛化葡聚糖（AC-DEX）的合成示意图

葡聚糖和缩醛化葡聚糖在DMSO-d6中的核磁共振氢谱如图2所示。相比于反应物葡聚糖而言，缩醛化葡聚糖的1H-NMR谱图中d＝1.26 ppm出现的氢谱峰证明了产物中甲氧基官能团的存在及缩醛化反应的发生。在此同时缩醛化葡聚糖上剩余羟基的活泼质子氢相对于葡聚糖发生漂移，由d＝4.79 ppm 和d ＝4.68 ppm漂移至d＝5.4 ppm和d＝5.06 ppm处，这可能由于缩醛化葡聚糖的羟基与甲氧基之间形成了氢键，当氢键形成时，氢变的更加趋于正电性。供电子基团较多的存在，供电子基团所形成的静电场将氢拉近，而将羟基氢上的电子推向氧，造成H周围的电子云密度降低，因而去屏蔽效应增加，质子的化学位移移向低场。

图2 缩醛化葡聚糖与葡聚糖在DMSO-d6中的1H-NMR谱图

图3 缩醛化葡聚糖和葡聚糖的红外谱图

按上述方法制备不同反应时间的缩醛化葡聚糖，称取1 mg与溴化钾研磨成粉末，压片，进行红外光谱分析。葡聚糖和缩醛化葡聚糖的傅里叶红外光谱图如图3所示，在缩醛化葡聚糖的红外谱图中，2992 cm-1与1378 cm-1的甲基峰，846 cm-1处异丙基的C-C伸缩振动吸收峰，有力地证明了葡聚糖已成功的发生了缩醛化反应。

2.2 缩醛化葡聚糖的水解

挑选缩醛化反应时间为1 h的缩醛化葡聚糖，从而用氘代盐酸和重水的混合物对缩醛化葡聚糖进行水解实验的探索。从最终的水解谱图4中看到缩醛化葡聚糖水解形成葡聚糖，丙酮和甲醇三种物质。化学位移d＝3.09 ppm和d＝1.88 ppm分别表示甲醇和丙酮中甲基的氢谱峰，d＝3.16～3.65 ppm为葡聚糖环和C6上的氢谱峰，而d＝4.63 ppm为葡聚糖上1号位的氢。以1号位的氢为基点，利用成环与非成环水解机理，通过计算相应的积分面积，可以求出反应1 h得到成环与非成环比例为3.46，同时计算出缩醛化反应程度为 80%，缩醛化葡聚糖的分子量为7 341 g/mol。

图4 缩醛化葡聚糖在重水（含5%氘代盐酸）中的1H-NMR谱图

2.3 缩醛化葡聚糖规律的探索

2.3.1 缩醛化葡聚糖中发生反应的羟基与反应时间的关系

如图1所示，缩醛化葡聚糖分子中，一摩尔成环的缩醛结构可水解成一摩尔丙酮；同时一摩尔非成环的缩醛结构则水解成一摩尔丙酮和一摩尔甲醇[6]。根据1H-NMR 分析结果，计算丙酮和甲醇的含量，则可以分别计算出成环结构、非成环结构的比例，根据葡聚糖分子（分子量5 000道尔顿）有30.8个重复单元，92.4个羟基，计算参与反应的羟基数目与百分数，绘制其与反应时间的关系图，如图5所示。由图5可以得出，缩醛反应快速发生并在0.5 h内达到97%。缩醛化反应为可逆反应，随着反应时间的增加，反应程度逐渐降低并逐渐保持不变。

图5 葡聚糖发生缩醛化反应的羟基转化率与反应时间的关系图

图6 不同反应时间下葡聚糖发生成环 和非成环结构的羟基的比例

2.3.2 缩醛化葡聚糖中发生成环与非成环的羟基数目与反应时间的关系

根据1H-NMR 分析结果，计算出发生成环、非成环反应的羟基数目，绘制其与反应时间的关系图，如图6所示。由图6可以看出，反应时间1 h以内，缩醛中非成环结构占主要部分，成环结构较少，1 h之后，成环结构的比例逐渐上升直至24 h，有66%的羟基发生成环的缩醛反应。

2.4 载药纳米粒子的粒径测定

将制备好的载药缩醛化葡聚糖纳米粒子溶液，用马尔文电位粒度仪检测其粒径分布，取三次测量值的平均值作为最终结果，所得载药纳米粒子的粒径为501.9±15.8 nm，其测试结果如图7所示，从动态光散射柱状图可以看出聚合物载药纳米粒子的粒径分布集中在500 nm左右，分布指数PDI为0.243。

图7 载药纳米粒子的动态光散射柱状图

图8 载药纳米粒子在不同pH条件下的荧光谱图

2.5 缩醛化葡聚糖纳米粒子酸敏性释药行为的测定

取制备的载药缩醛化葡聚糖纳米粒子PBS溶液（pH＝7.4），用荧光分光光度计检测载药纳米粒子中荧光药物阿霉素。将该测试溶液用0.01 mol/L的稀盐酸溶液调节成pH＝5.0，在酸性条件下用荧光分光光度计测定，10 min再次测定，其测试结果如图8所示。由图8中得出，在pH＝7.4时，荧光强度为90万左右，pH＝5.0的条件下，荧光强度迅速增强将近3倍，10 min后再次增强为5倍，药物阿霉素进一步被释放，说明所设计的纳米载药系统具有优秀的酸敏释药能力。上述测试结果表明酸敏型改性葡聚糖载体材料具有显著的酸敏感性，其反应性酸敏内核在酸性条件下可迅速由疏水性变为亲水性，快速释放药物，可以达到智能控释的目的。

3 结论

以可生物降解的亲水性天然葡聚糖为反应底物，通过缩醛化反应制备两亲性的缩醛化葡聚糖。核磁共振、傅里叶红外等理化表征手段确定缩醛化葡聚糖成功地合成。利用乳化法制备出的载药缩醛化葡聚糖纳米粒子用动态光散射法测得粒径为 501.9±15.8 nm。用乳化法制备的载药纳米粒子的释放具有优异的 pH响应性。荧光分光光度计检测载药纳米粒子在pH＝7.4缓冲介质中阿霉素荧光药物的酸敏释放行为。发现在pH＝5.0的缓冲介质中释放10 min之后，荧光强度较pH 7.4中增强5倍，说明所设计的纳米载药系统具有的酸敏释药功能。

[1] Wickham T J. Ligand-directed targeting of genes to the site of disease[J]. Nature Medicine, 2003, 9:135-139.

[2] Haag R. Supramolecular drug-delivery systems based on polymeric core–shell architectures[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2004, 43(3): 278-282.

[3] Yoo J W, Irvine D J, Discher D E, et al. Bio-inspired, bioengineered and biomimetic drug delivery carriers[J].Nature Reviews Drug Discovery, 2011, 10(7): 521-535.

[4] Fleige E, Quadir M A, Haag R. Stimuli-responsive polymeric nanocarriers for the controlled transport of active compounds: concepts and applications[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2012, 64(9):866-884.

[5] Dai J, Lin S, Cheng D, et al. Interlayer crosslinked micelle with partially hydrated core showing reduction and pH dual sensitivity for pinpointed intracellular drug release[J]. Angewandte Chemie International Edition,2011, 50(40): 9404-9408.

[6] Bachelder E M, Beaudette T T, Broaders K E, et al. Acetal-derivatized dextran: An acid-responsive biodegradable material for therapeutic applications[J]. Journal of the American Chemical Society, 2008,130(32): 10494-10495.

[7] Broaders K E, Cohen J A, Beaudette T T, et al. Acetalated dextran is a chemically and biologically tunable material for particulate immunotherapy[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Stated of America, 2009, 106(14): 5497-5502.