羊栖菜硫酸多糖的超声辅助提取工艺优化及抗氧化活性研究

董　乐，董笑瀛，王　芳，*，戴聪杰，林志杰，陈洪彬，刘灿阳

（1.泉州师范学院化学与生命科学学院，近海资源生物技术福建省高校重点实验室，福建泉州362000；2.吉林大学临床医学院，吉林长春130000）

羊栖菜硫酸多糖的超声辅助提取工艺优化及抗氧化活性研究

董乐1，董笑瀛2，王芳1，*，戴聪杰1，林志杰1，陈洪彬1，刘灿阳1

（1.泉州师范学院化学与生命科学学院，近海资源生物技术福建省高校重点实验室，福建泉州362000；2.吉林大学临床医学院，吉林长春130000）

为开发利用羊栖菜资源，对羊栖菜多糖（Sargassum fusiforme polysaccharides，SFPS）的提取工艺及其抗氧化活性进行了研究。在单因素实验基础上，通过二次回归正交旋转组合设计对超声波辅助提取SFPS粗品的工艺条件进行优化，得到最佳工艺参数为：超声时间13min、提取温度87℃和液料比46∶1mL·g-1，此时SFPS粗品提取率为8.23%± 0.01%。粗品中SFPS含量为31.20%±0.74%，硫酸根含量为10.93%±0.24%；SFPS的硫酸基含量41.88%±2.24%，SFPS为硫酸多糖。在一定范围内，SFPS粗品的抗氧化能力与多糖质量浓度呈线性正相关，对·OH、DPPH·、ABTS+·和O2-·的半数清除浓度（IC50）值分别为0.7068、0.4814、0.2527、1.2350mg·mL-1。

羊栖菜硫酸多糖，二次回归正交旋转组合设计，抗氧化活性

羊栖菜〔Sargassum fusiforme（Hary）Setch.〕属马尾藻科（Sargassaceae）、羊栖菜属（H izikia）［1］，在我国广泛分布于浙江、辽宁、山东、福建等省的沿海，其中以浙江温州地区尤为丰富［2］。羊栖菜营养丰富，尤其含有丰富的多糖［3］。各种动物实验和临床实验表明，羊栖菜多糖（Sargassum fusiforme polysaccharides，SFPS）具有免疫调节活性［4］、抗突变［5］、抗肿瘤［6］、抗凝血［7］、抗病毒［8］、降血脂［9］、降血糖［10］等生理活性。目前提取多糖常见方法有热水浸提、冷水浸提、酶法浸提、超声波提取和微波提取法［11］。超声波辅助提取通过其机械效应、空化效应及热效应，使介质分子的运动频率和速度增大，介质的穿透力增强，加速植物细胞壁的破裂，提高植物中活性成分的提取效率［12］。羊栖菜的藻体较硬，适合用机械的方法对其细胞壁进行破碎来提取多糖。张胜帮等［13］用超声波辅助法，采用L16（45）正交试验优化了提取SFPS的工艺条件。

二次回归正交旋转组合设计能以较少的实验处理建立一个有效的多项式回归方程，从而解决最优化问题，并寻找实验指标与各因子间的定量规律。本实验采用二次回归正交旋转组合设计对超声波辅助提取SFPS粗品的工艺条件进行优化，建立回归数学模型；并以对·OH、DPPH·、ABTS+·和O2-·的清除率为指标，评价SFPS粗品的抗氧化活性，为SFPS功能活性的深入研究及其多糖产品的开发提供理论依据和技术支持。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

羊栖菜购于浙江温州洞头县汇源海生物开发有限公司，自然干燥，用清水淋洗沥干水分后55℃烘干，粉碎后过80目筛密封备用；95%乙醇、无水乙醇、氯仿、正丁醇、木瓜蛋白酶、浓硫酸、苯酚、氯化钙、标准糖（葡聚糖、葡萄糖、岩藻糖/半乳糖3∶1）、三氯乙酸、氯化钡、明胶、盐酸、氯化钠、氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、溴化钾、过氧化氢国产分析纯；DPPH、ABTS、透析袋（截留相对分子质量3500ku） 厦门泰京生物科技有限公司；水超纯水。

W2-100S旋转蒸发仪上海申生科技有限公司；HH-4恒温水浴锅常州国华电器有限公司；KQ-600超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；GZX-9240MBE数显鼓风干燥箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂；TU-1950双光束紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；SHZ-III型循环水真空泵上海亚荣生化仪器厂；TDL-500B型低速大容量离心机上海安亭科学仪器厂；FA2104N型电子分析天平上海菁海仪器有限公司；ZNCL-B智能恒温磁力搅拌器巩义市予华仪器有限责任公司；FW100型高速万能粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司；PHSJ-4A实验室pH计上海精密科学仪器有限公司；LGJ-10D冷冻干燥机北京四环科学仪器厂有限公司。

1.2实验方法

1.2.1羊栖菜干粉水分含量的测定根据GB 5009.3-2010《食品安全国家标准—食品中水分的测定》第一法［14］测定羊栖菜干粉中的水分含量。

1.2.2SFPS粗品的提取准确称取一定重量粉末（WF）→加80%乙醇→80℃、2h脱色脱脂、烘干→称重（WT）→计算产物的净重率（WN）公式如下：

WT=WF×WN

准确称取折算为WF=5.00g粉末的上述产物WT，按单因素实验设计的液料比加水，并于常温下经超声波辅助提取后，按单因素实验设计的条件继续提取，离心后取上清液，沉淀按原液料比重新溶解，继续提取2h，离心后取上清液。合并2次的上清液进行减压浓缩后，用木瓜蛋白酶结合Sevag法［15］脱蛋白，重复2次，收集合并上清液，向其中加入乙醇和CaCl2，使其终浓度分别为20%和0.05mol·L-1，然后置于4℃过夜。室温下，4000r·min-1，离心10min后，收集的上清液进行透析48h。于减压浓缩的截留液中加入乙醇，使其终浓度为75%，静置4h，无水乙醇洗涤1次后，置于55℃烘干，即获得SFPS粗品（WS）。称重后计算SFPS粗品提取率，并测定粗品中SFPS含量及硫酸根含量。

SFPS粗品提取率（%）=WS/［WF×（1－水分含量）］

1.2.3单因素实验设计准确称取羊栖菜粉末5.0000g分别按液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1mL·g-1，提取温度50、60、70、80、90℃，超声时间10、20、30、40、50min进行单因素实验，其中固定液料比30∶1mL·g-1，温度80℃，时间30min，实验均重复3次。

1.2.4二次回归正交旋转组合实验以液料比、提取温度和超声时间为实验因素，以SFPS粗品提取率为响应值，进行3因素3水平的分析实验，优化SFPS粗品提取工艺条件。实验因素和水平见表1。

表1　二次回归正交旋转组合设计的因素水平编码值表Table 1　Factors and levels of quadratic regression rotatable orthogonal design

1.2.5粗品中SFPS含量的测定采用苯酚－硫酸比色法［16］。

将SFPS粗品配制成200μg·mL-1溶液。取0.5mL定容液（用蒸馏水补足2mL），然后加入1.0mL 6%苯酚及5.0mL浓H2SO4，摇匀冷却至室温，放置20min后测溶液的吸光度（A）。每次测定取双样。以标准曲线计算SFPS含量。

SFPS含量（%）＝［C×V×D/WS］×100

式中，C—根据标准曲线计算出SFPS粗品的浓度（μg·mL-1）；V—SFPS粗品溶液定容的体积（mL）；D稀释的倍数；WS—SFPS粗品的质量（g）。

1.2.6SFPS的硫酸根含量测定用氯化钡－明胶比浊法［17］进行。

1.2.7SFPS粗品的抗氧化活性测定对·OH、DPPH·、ABTS+·和O2-·清除率的测定均按文献进行［18-21］。

1.2.8半数清除（抑制）浓度（IC50）的计算以SFPS的浓度对自由基清除率作图并进行线性拟合，并利用计算机插值法模拟计算IC50值。IC50值定义为清除率为50%时所需SFPS的浓度。

1.2.9统计学分析所有实验至少重复3次。用Excel、SPSS 13.0软件和Design-Expert 8.05软件系统进行统计学处理，以p＜0.05判断为有统计学意义。

2　结果与分析

2.1羊栖菜粉末的水分含量

羊栖菜干粉的含水量为6.54%±0.04%（n=3）。

2.2单因素实验

2.2.1液料比对SFPS粗品提取率的影响结果如图1所示，由于SFPS是水溶性多糖，随液料比增大，SFPS粗品提取率增加。当液料比为30∶1mL·g-1时，SFPS粗品提取率达到最高，为4.21%，继续提高液料比，SFPS粗品提取率反而下降。这可能是因为其它成分的溶解量随液料比增加而增加，从而改变了提取液的性质，或者与SFPS发生了互作，造成SFPS粗品提取率降低。故选择液料比为30∶1mL·g-1为宜。

图1　液料比对SFPS粗品提取率的影响Fig.1　Effect of the ratio of liquid to solid on the yield of the crude SFPS

2.2.2提取温度对SFPS粗品提取率的影响结果如图2所示，SFPS粗品提取率随着提取温度升高而增加。由于温度影响SFPS的活性，适宜的提取温度一般小于100℃，因此本实验选择提取温度为90℃。

图2　提取温度对SFPS粗品提取率的影响Fig.2　Effect of extraction temperature on the yield of the crude SFPS

2.2.3超声时间对SFPS粗品提取率的影响粗品提粗品提结果如图3所示。SFPS的提取过程与超声处理时间密切相关。SFPS粗品提取率随超声时间延长而增加，当超声时间达到30min时，SFPS粗品提取率达到最高6.01%。继续增加超声时间，SFPS粗品提取率反而下降。这可能是由于时间过长，大分子多糖在超声波的强剪切作用下发生断裂而损失，使提取率下降［17］。故超声提取的时间选择在30min为宜。

图3　超声时间对SFPS粗品提取率的影响Fig.3　Effect of ultrasonic-irradiation time on the yield of the crude SFPS

2.3SFPS粗品提取的工艺优化分析

2.3.1实验设计与最佳工艺参数确定SFPS粗品提取的结果见表2。

表2　二次回归正交旋转组合实验设计及结果Table 2　Quadratic regression rotatable orthogonal experiment design and the results of these experiments

利用Design-Expert 8.05软件对实验结果进行分析，得到以SFPS提取率为响应值的回归方程：

由方差分析（见表3）可知，总的回归关系极显著，失拟项不显著（p＞0.05），C.V.＝2.29%，精密度＝17.0231。R2Adj为0.9089，说明建立的模型能够解释90.89%响应值的变化，能很好地描述SFPS提取过程中提取率随提取条件的变化规律。因此，该模型可用于预测SFPS提取过程中的提取率情况。

表3　二次回归正交旋转组合设计的方差分析Table 3　Analysis of variance（ANOVA）for the fitted quadratic polynomial model

由方差分析见表3。结果表明，提取温度和超声时间的交互作用显著，但液料比与提取温度及超声时间之间的交互作用不显著，超声时间的一次项也不显著，因此应当从回归方程中剔除。

表4　二次回归正交旋转组合设计的二次方差分析Table 4　Quadratic analysis of variance（ANOVA）for the fitted quadratic polynomial model

将X1X2、X1X3和X3从回归方程中剔除，且将其平方和和自由度并入实验误差，进行第二次方差分析，结果见表4。二次方差分析表明，除X1的二次项未达显著外，其余各项均达显著水平，但X12在0.10水平上显著，所以应将其保留在回归方程。失拟项不显著（p＜0.05）。故回归方程为：

在3个实验因素的编码范围内，运用Excel规划求解得到SFPS提取的最佳工艺参数为：液料比为45.8∶1 mL·g-1，提取温度为87.4℃，超声时间13min。考虑到实际操作的便利，确定优化提取工艺参数为：液料比为46∶1mL·g-1，提取温度为87℃，超声时间13min。在最佳工艺条件下SFPS粗品提取率预测值为8.54%。

2.3.2最佳工艺参数验证性实验在最佳工艺条件下SFPS粗品提取率的验证值为8.23%±0.01%（n＝5），与理论预测值相比，相对误差为3.6%（p＜0.05），证明了二次回归正交旋转组合设计优化SFPS的提取工艺参数的可行性。利用最优工艺提取的羊栖菜粗多糖命名为SFPS粗品。

2.4SFPS粗品的SFPS含量

SFPS粗品的SFPS含量测定标准曲线见图4。葡萄糖标准品溶液在0～0.5360μg·mL-1浓度范围内与吸光度线性关系良好，标准曲线回归方程为y＝0.0134x－0.0089，r＝0.9983，n＝6。

图4　葡萄糖标准曲线Fig.4　The standard curve of dextrose concentration

图5　硫酸根标准曲线Fig.5　The standard curve of sulfate-radical concentration

SFPS粗品中SFPS含量为31.20%±0.74%（n＝3）。

2.5SFPS粗品的硫酸根含量

SFPS粗品的硫酸根含量测定标准曲线见图5。硫酸根在0～67.6056μg·mL-1浓度范围内与吸光度线性关系良好，标准曲线回归方程为y＝0.0078x－0.0241，r＝0.9950，n＝6。

SFPS粗品的硫酸基含量为10.93%±0.24%（n＝3），SFPS的硫酸基含量41.88%±2.24%（n＝3），因此，SFPS为硫酸多糖。

2.6SFPS粗品的抗氧化活性

由图6可见，SFPS粗品对·OH、DPPH·、ABTS+·和 O2-·均有一定的清除能力，对4种自由基的清除率均随浓度增大而增强，且SFPS粗品的浓度与抑制自由基的能力均呈现出明显的量效关系。在测定浓度范围内，SFPS粗品对DPPH·的清除率达到一定程度趋于平衡。利用计算机插值法模拟结果表明，SFPS粗品对·OH、DPPH·、ABTS+·和O2-·的IC50分别为0.7068、0.4814、0.2527、1.2350mg·mL-1，分别低于维生素C对·OH、DPPH·、ABTS+·和O2-·的IC50，即分别低于0.5911、0.0814、0.0946、0.3912mg·mL-1。

图6　SFPS粗品的抗氧化活性Fig.6　The antioxidative activity in vitro of the crude SFPS

3　结论

利用二次回归正交旋转组合优化超声波辅助提取SFPS粗品的回归数学模型为：＝3.36182＋0.04214X1＋0.11558X2－0.07004X3＋0.00093X2X3－0.00046X12－0.00073X22－0.00272X32。此模型在实验范围内能较准确预测SFPS粗品提取率。通过此数学模型，确定最优工艺参数：液料比46∶1mL·g-1、提取温度87℃和超声时间13min。在该工艺条件下SFPS粗品提取率预测值为8.54%，验证值为8.23%±0.01%，说明二次回归正交旋转组合设计优化SFPS粗品的提取工艺参数是可行的。SFPS粗品中多糖含量为31.20%± 0.74%，硫酸根含量为10.93%±0.24%，SFPS的硫酸根含量为41.88%±2.24%，说明提取的SFPS为硫酸多糖。SFPS粗品对·OH、DPPH·、ABTS+·和O2-·的IC50分别为0.7068、0.4814、0.2527、1.2350mg·mL-1，抗氧化活性低于维生素C。

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Optimization of extraction and antioxidative activity in vitro of sulfated polysaccharides from Sargassum fusiforme（Hary）Setch.

DONG Le1，DONG Xiao-ying2，WANG Fang1，*，DAI Cong-jie1，LIN Zhi-jie1，CHEN Hong-bin1，LIU Can-yang1
（1.College of Chemistry and Life Science，Quanzhou Normal University，the Higher Educational Key Laboratory for Offshore Resources and Biotechnology of Fujian Province，Quanzhou Normal University，Quanzhou 362000，China；2.Clinical Medical College of Jilin University，Changchun 130000，China）

In order to exploit resources of Sargassum fusiforme（Hary）Setch.，the extraction and antioxidative activity of the polysaccharides from S.fusiforme（SFPS）was investigated respectively.Based on single experiments，with yield of crude SFPS as index，extraction temperature，ultrasonic-irradiation time and ratio of liquid to solid were selected as factors，the extraction technology of the crude SFPS was optimized by quadratic regression rotatable orthogonal combinition design method.The results showed that the optimal extraction conditions were 87℃，46∶1mL·g-1with 13min．The corresponding extraction yield of crude SFPS was 8.23%±0.01%.The sulfate-radical concentration of the crude SFPS was 10.93%±0.24%.The SFPS content of the crude SFPS was 31.20%±0.74%.The sulfate-radical concentration of the SFPS was 41.88%±2.24%.The SFPS were sulfated.There was a linear positive correlation between the antioxidant ability of SFPS and the concentration in certain extent.The half-scavenging concentration IC50values of the crude SFPS against·OH，DPPH·，ABTS+·and O2-·radicals were 0.7068，0.4814，0.2527，1.2350mg·mL-1respectively.

sulfated polysaccharides from Sargassum fusiforme（Hary）Setch.；quadratic regression rotatable orthogonal design；antioxidative activity

TS254

A

1002-0306（2015）12-0265-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.047

2014－9－25

董乐（1966－），男，硕士，副教授，研究方向：食品生物技术研究。

王芳（1969－），女，博士，教授，研究方向：生物技术研究。

福建省科技项目计划海洋经济发展专项重点项目（2015N0014）；福建省高校服务海西建设重点项目（A101）；福建省生物学省级重点学科建设项目（zdxk）；泉州市“海纳百川”高端人才聚集计划高端海洋人才引进资助项目；泉州市科技计划重点项目（2011Z16，2013Z126）；国家级大学生创新创业计划项目（201310399009，201410399029）。