牛磺酸对丙烯酰胺致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用

郝瑞芳，景　浩（.山西林业职业技术学院园艺系，山西太原030009；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京00083）

牛磺酸对丙烯酰胺致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用

郝瑞芳1，景浩2，*
（1.山西林业职业技术学院园艺系，山西太原030009；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

用丙烯酰胺诱导SH-SY5Y神经细胞损伤建立细胞损伤模型，研究牛磺酸对SH-SY5Y细胞的保护作用。MTT法和LDH法测定结果显示：用100～700 μg/mL丙烯酰胺对SH-SY5Y细胞孵育8 h，细胞存活率下降至52%～81%，表明丙烯酰胺对SH-SY5Y细胞有一定的损伤作用，导致细胞膜受损，LDH释放到细胞膜外。经牛磺酸（50、100、200 μg/mL）预先孵育1 h后，再用300 μg/mL丙烯酰胺对细胞孵育8 h，SH-SY5Y细胞的存活率分别升高至81.6%、92.7%、89.7%，显著高于丙烯酰胺损伤组的细胞存活率（67.6%）；且LDH释放程度呈现出下降趋势，LDH释放率分别为：150.7%、138.8%、113.3%，和丙烯酰胺损伤组的LDH释放率（188.5%）相比均显著降低。该研究结果表明牛磺酸对丙烯酰胺诱导的SHSY5Y细胞损伤具有保护作用。

牛磺酸，丙烯酰胺，SH-SY5Y细胞，损伤

丙烯酰胺（Acrylamide）对大鼠肝细胞、鼠肾上皮细胞、人角质形成细胞、神经胶质细胞均具有毒性作用，可引起细胞发生氧化应激损伤［1-4］。丙烯酰胺能降低SH-SY5Y细胞的活力，增加乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）的释放量，促进细胞的凋亡。LDH是细胞能量代谢中的一个重要的酶，细胞释放LDH增加，通常反映细胞受损伤，细胞膜通透性增加。

牛磺酸（Taurine）主要存在于心肌细胞，对肝细胞、心肌细胞、红细胞等都具有保护作用。牛磺酸能够维持细胞内外渗透压平衡，调节细胞钙稳态。牛磺酸可能通过激活膜表面钙泵使细胞浆内Ca2+泵出细胞或进入细胞内的钙库，从而抑制细胞内钙超载［5］。牛磺酸还具有抗氧化作用，能清除氧自由基，抑制细胞膜的过氧化损伤，保护膜的稳定性。牛磺酸参与细胞膜的主要成分磷脂的代谢，保护细胞膜磷脂免受降解，调节膜对离子的通透性并呈剂量依赖地抑制溶酶体内组织蛋白酶的漏出。牛磺酸还能抑制四氯化碳引发的脂质过氧化作用，减少丙二醛的生成、丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶的释放，有效保护肝细胞［6］。

SH-SY5Y神经细胞株来源于人类胚胎中脑，是一种分化程度较低的神经母细胞瘤。其细胞形态和生理功能与正常神经元相似，被广泛用于神经损伤的分子机制研究。本实验选用SH-SY5Y细胞，用丙烯酰胺诱导细胞损伤，建立细胞损伤模型，探讨牛磺酸对丙烯酰胺致SH-SY5Y细胞的损伤是否具有保护作用。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

人神经母细胞瘤SH-SY5Y购自中国协和医科大学；高糖型DMEM培养液美国Invitrogen公司；胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）北京鼎国生物技术有限责任公司；胰蛋白酶、噻唑蓝（MTT）、丙酮酸钠、还原型NADH美国Sigma公司；丙烯酰胺标准品，纯度99.5%德国Labor Dr.Ehrenstorfer-Schafers公司；牛磺酸国药集团化学试剂有限公司；其他药品均为国产分析纯。

MCO-15AC型二氧化碳培养箱日本SANYO（三洋）公司；XDL-2型倒置生物显微镜重庆光电仪器有限公司；BSC-1500ⅡA2-X型生物安全柜济南市鑫贝西生物技术有限公司；680型酶标仪美国Bio-Rad公司；FA1004型电子天平上海越平科学仪器有限公司；UNICO 2800型紫外分光光度计上海沪粤明科学仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1试液配制

1.2.1.1丙烯酰胺（99.5%）储备液配制浓度为1.0 mg/mL的丙烯酰胺溶液，作为储备液。

1.2.1.2磷酸盐（PBS）缓冲液配制称取KH2PO40.20 g，Na2HPO4·12H2O 2.90 g，KCl 0.20 g，NaCl 8.00 g，加900 mL去离子水溶解，用18%的HCl调pH至7.4，最后定容至1 L。

1.2.1.3牛磺酸溶液和丙烯酰胺溶液用PBS缓冲液溶解牛磺酸和丙烯酰胺，分别配制成5 mg/mL的储备液，在生物安全柜内用0.22 μm滤膜过滤除菌，备用。临用前分别用不含血清的DMEM培养液稀释到所需浓度。

1.2.2细胞培养将SH-SY5Y细胞培养于含20%胎牛血清的高糖DMEM培养液，置于CO2培养箱（37℃，5%CO2）培养。当细胞生长至80%～90%融合时，进行传代。每3～4 d传代一次。取对数生长期细胞分组进行实验。

1.2.3牛磺酸对细胞生长的影响将对数生长期的细胞消化，制备成均匀的细胞悬液。取96孔细胞培养板，每孔加100 μL细胞悬液，细胞密度为5×105个/mL。培养48 h后弃培养液，每孔加入100 μL含不同浓度（50、100、200、400 μg/mL）的牛磺酸溶液，37℃孵育8 h；弃去牛磺酸溶液，每孔加入100 μL培养液继续培养48 h，在倒置显微镜下观察细胞形态，并用MTT法检测细胞活性。

MTT法步骤如下：不同浓度的牛磺酸处理组均设3个重复孔，以不加细胞悬液和牛磺酸的组为空白组，以加PBS处理的正常细胞组为对照组；各组细胞培养结束时，弃去各孔中的培养液，加入100 μL不含血清的DMEM-MTT溶液（MTT终浓度0.5 mg/mL），在细胞培养箱内继续孵育4 h；加入100 μL盐酸-异丙醇溶液（含0.04 moL/L HCl）/孔，振荡至蓝紫色结晶完全溶解；用酶标仪于570 nm处测定各孔的吸光值（Abs570），以吸光值反映细胞的生长抑制。

1.2.4细胞损伤模型的建立SH-SY5Y细胞接种于96孔板培养48 h后弃培养液，每孔加入100 μL含不同浓度的丙烯酰胺溶液（终浓度100～700 μg/mL），37℃孵育2～12 h；弃去丙烯酰胺溶液，每孔加入100 μL培养液继续培养24 h，用MTT法测定细胞存活率，确定细胞损伤模型的丙烯酰胺浓度［7］。

1.2.5牛磺酸对丙烯酰胺致细胞损伤的保护作用

1.2.5.1细胞处理根据上述实验结果确定牛磺酸和丙烯酰胺的剂量。实验设计对照组（正常细胞组）、牛磺酸-200组、丙烯酰胺损伤组、实验组（高、中、低浓度的牛磺酸+丙烯酰胺）。SH-SY5Y细胞接种于96孔板培养48 h后弃去培养液，然后给予牛磺酸和丙烯酰胺处理。具体步骤如下：实验组每孔先加入50 μL牛磺酸溶液（终浓度为50、100、200 μg/mL），对照组、牛磺酸-200组和损伤组给予等体积的不含血清的DMEM培养液，37℃预孵育1 h后，对照组再加入50 μL不含血清的DMEM培养液，牛磺酸-200组再加入50 μL牛磺酸溶液（终浓度200 μg/mL）；其余组均加入50 μL丙烯酰胺（终浓度300 μg/mL），进行损伤处理（细胞于37℃继续孵育8 h）。损伤处理结束后，所有组均弃去各孔中的样品溶液，加100 μL细胞培养液继续培养24 h。用倒置显微镜观察细胞形态，并进行细胞存活率和LDH释放率的测定。

1.2.5.2细胞形态的观察接种于96孔培养板的细胞经牛磺酸和丙烯酰胺处理结束后，在倒置显微镜下观察并拍照，物镜放大倍数为10倍，目镜放大倍数为10倍，总放大倍数为100倍。

1.2.5.3LDH释放量的测定将SH-SY5Y细胞接种于24孔细胞培养板培养24 h后弃培养液，每孔先加入500 μL牛磺酸（终浓度50、100、200 μg/mL）预孵育1 h，再加入500 μL丙烯酰胺（终浓度300 μg/mL）进行损伤处理8 h。损伤处理结束后收集各孔内溶液至1.5 mL离心管中，500 r/min离心10 min。取100 μL离心后的上清液，加2 mL Tris-EDTA-NADH溶液，混合，37℃孵育10 min，再加入200 μL预热（37℃）过的丙酮酸钠溶液，快速混匀（限制在3 s内），用紫外分光光度计在340 nm处测定吸光值，并记录3 min反应时吸光值的下降数值，LDH释放率用实验组的吸光值下降数值与对照组的吸光值下降数值的比值表示［8］。

1.2.6统计分析每个实验重复三次，每个重复测定三次，结果表示为Means±SD。采用MINITAB 13.20软件进行One-way ANOVA分析。邓肯氏多重检验用来确定数据间的差异，显著水平为p＜0.05。

2　结果与分析

2.1牛磺酸对SH-SY5Y细胞生长的影响

从表1可以看出，用50～200 μg/mL的牛磺酸对SH-SY5Y细胞孵育4 h，牛磺酸不仅对细胞生长无抑制作用，还显著促进了细胞的生长；当浓度达到400 μg/mL时，牛磺酸对细胞生长有显著抑制作用，细胞存活率低于90%。孵育6～8 h，牛磺酸为50～200 μg/mL时，对SH-SY5Y细胞的生长无促进也无抑制作用，浓度为400 μg/mL时会显著抑制细胞的生长，存活率下降至84.2%。最终确定用浓度为50、100、200 μg/mL的牛磺酸来探讨对丙烯酰胺致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。

表1　牛磺酸对SH-SY5Y细胞生长的影响Table 1　Effect of taurine on cell growth of SH-SY5Y

2.2丙烯酰胺对SH-SY5Y细胞生长的抑制

从图1可以看出，丙烯酰胺浓度介于100～400 μg/mL时，孵育4～6 h，对SH-SY5Y细胞的生长影响较小，细胞存活率为90%以上，和对照组相比无显著差异；随着丙烯酰胺浓度继续升高，细胞存活率显著降低，最低为70%；孵育8 h时，丙烯酰胺浓度为100 μg/mL即显著抑制SH-SY5Y细胞的生长，细胞存活率降至81%；丙烯酰胺为300 μg/mL时，细胞的存活率为70%；当丙烯酰胺为700 μg/mL时，细胞的存活率仅为52%，该结果与文献的研究结果基本一致［9-10］。因此，选用浓度为300 μg/mL的丙烯酰胺对SH-SY5Y细胞孵育8 h建立细胞损伤模型。Okuno等［9］研究表明丙烯酰胺对SH-SY5Y细胞具有毒性作用，细胞的存活率与丙烯酰胺的浓度和孵育时间呈依赖性。用0.5～5 mmoL/L的丙烯酰胺对SH-SY5Y细胞孵育20 h，细胞存活率最低70%；用5 mmoL/L的丙烯酰胺孵育0～24 h，细胞存活率也随时间的延长逐渐下降，最低约70%。用1～5 mmoL/L的丙烯酰胺对SHSY5Y细胞孵育20 h，结果表明细胞存活率随丙烯酰胺浓度的增加而逐渐下降，最低至约30%［10］。

图1　丙烯酰胺对SH-SY5Y细胞生长的抑制作用Fig.1　Inhibitory effect of acrylamide on cell growth of SH-SY5Y

2.3牛磺酸对丙烯酰胺致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用

2.3.1细胞形态学变化如图2所示，正常对照组的SH-SY5Y细胞生长良好，形态正常，呈锥体状并有明显的轴突，胞体均匀分布，轮廓清晰、胞浆均匀。单独加牛磺酸（200 μg/mL）孵育8 h，SH-SY5Y细胞同样生长良好，胞体均匀分布，与对照组无差别。单独加丙烯酰胺孵育8 h，活细胞数量明显减少，贴壁细胞变稀疏，细胞胞体皱缩、脱落、死亡；存活的细胞体积明显变小，细胞长得不饱满，胞质回缩，大小不一致。经不同浓度的牛磺酸保护后，细胞损伤程度明显减轻，和丙烯酰胺损伤组相比，细胞形态有明显改善，活细胞数量明显增多，且牛磺酸的浓度越高，对细胞的保护作用越大，中、高剂量保护组之间活细胞数量差异不明显（图2）。

图2　牛磺酸对丙烯酰胺致SH-SY5Y细胞形态改变的保护作用Fig.2　Protective effect of taurine on morphological change induced by acrylamide in SH-SY5Y cell

2.3.2细胞存活率和LDH释放率本实验以MTT法检测细胞存活率，对照组对SH-SY5Y细胞孵育8 h，细胞生长良好，存活率为99.4%；单独加入丙烯酰胺作用8 h，SH-SY5Y细胞的生长明显受到抑制，细胞存活率仅为67.6%；经不同浓度的牛磺酸保护后，牛磺酸为50、100和200 μg/mL时，SH-SY5Y细胞的存活率分别为81.6%、92.7%、89.7%，细胞存活率显著增强。高、中剂量的牛磺酸对细胞的保护作用显著高于低剂量组（表2）。

表2还显示了不同组中LDH的释放量情况。与对照组相比，丙烯酰胺单独作用SH-SY5Y细胞8 h后，细胞LDH的释放率显著升高，达到188.5%，说明丙烯酰胺对SH-SY5Y细胞具有毒性作用，细胞膜受损，导致LDH释放到膜外的量增加。经不同浓度的牛磺酸保护后，LDH释放程度呈现出下降趋势，和丙烯酰胺损伤组相比均有显著降低，且添加物浓度越高，对细胞的保护作用越强。和正常对照组比较，高、中、低浓度的牛磺酸保护组中LDH释放率分别为：113.3%、138.8%、150.7%，高剂量组对细胞的保护作用明显高于中、低剂量组。

MTT和LDH的结果显示，牛磺酸对丙烯酰胺导致的SH-SY5Y细胞损伤具有显著的保护作用，保护作用与牛磺酸的添加浓度有关。

表2　牛磺酸对丙烯酰胺致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用Table 2　Protective effect of taurine on acrylamide-induced cytotoxicity in SH-SY5Y cell

3　讨论

已有大量文献报道丙烯酰胺具有一定的细胞毒性作用。用10～100 μmol/L的丙烯酰胺对小鼠肾上皮细胞孵育7 d，丙烯酰胺可明显抑制细胞分化，表现为细胞集落数目减少，出现细胞脱落、漂浮、细胞碎片等现象，蛋白质含量下降，说明该浓度范围的丙烯酰胺对新生小鼠肾上皮细胞有明显的毒作用［4］。Sumizawa等［10-11］研究表明丙烯酰胺（1～3 mmoL/L）能降低SH-SY5Y细胞的存活率，增加LDH的释放量；丙烯酰胺还诱导SH-SY5Y细胞在sub G1周期中的数量显著增加，激活细胞内的caspase-3活性，从而导致细胞凋亡。

牛磺酸具有抗氧化作用，能清除氧自由基，抑制细胞膜的过氧化损伤。胡锦东等［12］研究发现牛磺酸可拮抗铅引起的大鼠肝脂质过氧化损伤，使染铅大鼠体内的丙二醛含量下降，并明显恢复超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活力，使其恢复到正常对照组水平，体现了牛磺酸的保护作用。庄园等［13］研究了牛磺酸对高温处理后神经上皮细胞存活和分化的影响。结果显示：牛磺酸对高温处理后神经管上皮细胞的存活具有保护作用。本实验研究结果表明，牛磺酸对丙烯酰胺致SH-SY5Y细胞损伤有显著的保护作用，说明牛磺酸对细胞具有很好的保护作用，能够抑制丙烯酰胺的细胞损伤作用，推测牛磺酸对丙烯酰胺致细胞损伤的抑制作用通过两种途径来实现：a.牛磺酸与丙烯酰胺结合形成加合物，降低了细胞孵育液中丙烯酰胺的浓度，从而减弱其对细胞的损伤作用。作者已证实在化学反应体系中牛磺酸可与丙烯酰胺结合形成加合物［14］。b.牛磺酸具有抗氧化作用，能清除氧自由基，稳定细胞膜，减弱了丙烯酰胺对细胞造成的损伤作用。

4　结论

用浓度为50～200 μg/mL的牛磺酸对SH-SY5Y细胞孵育8 h，对细胞的生长无任何影响。用丙烯酰胺（300 μg/mL）对SH-SY5Y细胞孵育8 h，细胞存活率显著下降；而经牛磺酸（50、100、200 μg/mL）保护后，细胞存活率显著提高，LDH释放量显著降低。这表明牛磺酸在浓度为50～200 μg/mL时对丙烯酰胺诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有保护作用，保护作用强弱依次为：中剂量组＞高剂量组＞低剂量组。

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Protective effects of taurine on SH-SY5Y cells injury induced by acrylamide

HAO Rui-fang1，JING Hao2，*
（1.Department of horticulture，Shanxi Forestry Vocational Institute，Taiyuan 030009，China；2.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

The preventive effects of taurine on acrylamide-induced cell injuries of human neuroblastoma cells（SH-SY5Y）were investigated by using cellular morphology，MTT assay and LDH assay.The results showed that the cell viabilities were decreased to 52%～81%when SH-SY5Y cells were incuvated 8 h with acrylamide of 100～700 μg/mL，which showed that acrylamide induced the cell membrane damage and LDH release outside cell membrane.The cell viability was decreased to 67.6%and LDH release rate was increased to 188.5%when SH-SY5Y cells were only incubated 8 h with acrylamide of 300 μg/mL in acrylamide injury group. However，when SH-SY5Y cells were pre-protected 1 h with taurine of 50，100 and 200 μg/mL before incubation 8 h with acrylamide of 300 μg/mL，taurine resulted in significant increases of SH-SY5Y cell viability to 81.6%，92.7%and 89.7%，and decreases of LDH release to 150.7%，138.8%and 113.3%as compared with that in acrylamide injury group.These demonstrated that taurine could protect SH-SY5Y cells from acrylamideinduced injury.

taurine；acrylamide；SH-SY5Y cells；injury

TS201.2

A

1002-0306（2015）20-0364-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.066

2015－01－30

郝瑞芳（1978-），女，博士，讲师，研究方向：食品安全与质量控制，E-mail：471518969@qq.com。

景浩（1957-），男，博士，教授，研究方向：生物活性物质与功能性食品，E-mail：106263189@qq.com

国家自然科学基金资助项目（31171676）。