梅毒螺旋体不同接种途径对家兔致病性研究初探

王琪 尹跃平 龚匡隆

梅毒螺旋体不同接种途径对家兔致病性研究初探

王琪 尹跃平 龚匡隆

目的 探讨不同接种途径建立的梅毒家兔模型的发病及免疫应答情况。方法 20只家兔随机分为睾丸接种组及背部皮内接种组，每组10只。睾丸接种组家兔睾丸注射2×107梅毒螺旋体Nichols株。背部皮内接种组家兔背部剃毛后选取6个点进行皮内注射，6个点共注射2×107梅毒螺旋体Nichols株。观察两组家兔的临床症状及血清学反应情况。结果 睾丸接种组接种后第8天，睾丸开始肿大变硬，13～16 d肿大最为明显，之后逐渐缩小，至接种后28 d所有家兔睾丸回缩，触诊未见肿大变硬；发病2个月内未发现其他部位出现皮损。背部皮内接种组接种后7 d，接种部位皮肤出现红肿，15～45 d皮损红肿最为明显，且出现溃疡，有3只家兔共12个接种点的皮肤发生溃疡，暗视野检查阳性，触诊呈软骨样硬度。睾丸接种组接种后（14.50±1.08）d时临床症状最为明显，皮内接种组（29.00±10.30）d时临床症状最为明显，两组比较，t＝5.02，P＜0.05。两组家兔快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）最高滴度分布经秩和检验，差异有统计学意义（P＜0.05），睾丸接种组滴度高于背部皮内接种组。结论 梅毒螺旋体接种家兔不同部位，引起家兔不同的临床症状及免疫反应。睾丸接种组RPR阳性时间早，且滴度高。背部皮内接种组的临床症状类似于人类一期梅毒硬下疳表现。

梅毒；苍白密螺旋体；疾病模型，动物；兔

梅毒螺旋体（Treponema pallidum，Tp）尚不能人工培养，限制了对梅毒的深入研究［1］。梅毒的临床治疗药物主要是青霉素［2］，但有些过敏患者需要选择其他替代药物。为了筛查或验证药物的有效性，建立梅毒螺旋体药效评价模型至关重要。研究发现，Tp可在猿猴、小鼠、仓鼠、豚鼠及家兔体内繁殖［3-4］。其中家兔睾丸接种可获得大量Tp，利于菌种的收集与保存，是目前研究常用的梅毒感染动物。本实验拟通过Tp的不同接种途径探讨梅毒家兔模型的发病及免疫应答情况，为建立梅毒螺旋体药效评价模型提供依据。

资料与方法

一、资料

1.实验动物：睾丸成熟的纯种新西兰雄兔（南京金陵种兔场；动物合格证号0897），20只，体重2.8～3.5 kg，兔龄3个月左右，饲养于18～22℃的IVC兔笼中，饲料（南京青紫兰生物科技有限公司）及饮水均不含抗生素。

2.菌株：保存于中国医学科学院皮肤病研究所参比实验室的Tp Nichols标准株。

3.试剂：快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）试剂盒（上海科华生物工程股份有限公司）；梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）试剂（珠海丽珠股份有限公司）；正常家兔血清盐溶液（NRS盐溶液，生理氯化钠溶液与正常家兔血清混合）为实验室自制。

二、方法

1.Tp菌悬液制备：取2个保存于液氮中的梅毒兔模型睾丸，将睾丸沿纵线方向切成10多个小片，但不完全切开（每个小片呈蝴蝶形）。之后放入约10 ml 20%NRS盐溶液，用无菌纱布盖住烧杯口后，水平摇晃烧杯将液体混匀，并用镊子挤压睾丸以使更多的Tp溶于盐溶液中，暗视野观察到Tp进行接种，共接种2只家兔。接种后隔3 d触诊睾丸。睾丸肿大变硬后每日触诊睾丸。待睾丸肿大及硬度连续3 d无变化时，注射空气处死家兔，75%乙醇消毒睾丸，取下睾丸。以同样方法将睾丸制作成菌悬液。连续传代，当睾丸菌悬液至（1～5）×107Tp/ml［5］时停止传代。取4个满足实验要求的睾丸置于A、B两个不同的烧杯中，每个烧杯中各2个睾丸。A烧杯中放入约60 ml 20%NRS盐溶液制作菌悬液，暗视野显微镜观察每视野约50个Tp［5］。B烧杯中加入24ml50% NRS盐溶液制备Tp菌悬液［6］，暗视野观察每视野约120个Tp。A、B两烧杯菌悬液备好后需1 h内接种家兔。

2.感染方法：取20只正常家兔，称重后根据随机数字表将其随机分为睾丸接种组及背部皮内接种组，每组10只。实验前每只家兔耳缘静脉取血做RPR及TPPA检测，确定其未感染梅毒螺旋体。睾丸接种组：使用安尔碘消毒睾丸，每个睾丸注射A烧杯中的菌悬液1.5 ml（1×107Tp），每只家兔注射2×107Tp。背部皮内接种组：背部剃毛后选择6个点，使用苦味酸溶液对6个点进行标记，每个点皮内注射B烧杯中的菌悬液0.2 ml（0.35×107Tp），每只家兔注射2×107Tp。

3.家兔感染状况观察：本实验为期2个月。

（1）家兔大体情况观察：每日观察家兔精神及饮食状况。通过敲击兔笼观察家兔对刺激的反应，确定其有无亢奋或消沉，若对刺激无反应，则家兔精神低沉；若反应激烈，则家兔精神亢奋；每只家兔每日喂食50 g/kg兔粮，隔日观察兔粮剩余情况，确定有无厌食或贪食。每周测量家兔体重。

（2）临床症状观察：每2天触诊睾丸接种组家兔睾丸，根据睾丸肿大变硬、回缩状况及溃疡发生情况将睾丸发病分级（表1）。每2天观察背部皮内接种组家兔背部皮损发展情况，根据皮损肿大的宽度、高度及是否发生溃疡将皮损分级（表1）。

表1 梅毒螺旋体不同接种途径感染的两组家兔临床症状分级标准

（3）家兔血清学检测：每2天取家兔耳缘静脉血1 ml于真空抗凝管中，离心后取血浆，按试剂操作说明书及标准操作程序进行RPR及TPPA试验［7］。

4.统计学分析：采用SPSS20.0统计软件包，两组比较，计量资料使用t检验，RPR滴度分布使用秩和检验，检验水平α＝0.05。

结果

一、家兔大体情况

实验结束时，两组家兔饮食情况未见异常。2只睾丸接种组家兔及1只背部接种组家兔出现精神亢奋，其余17只家兔精神状态未见异常。两组家兔体重分别增加（0.85±0.19）kg及（0.75±0.22）kg，两组比较，t=1.081，P=0.29。

二、家兔临床表现

感染确立的简单指标：睾丸组家兔睾丸肿大变硬无回缩为感染成功；皮内接种组家兔接种部位出现红斑或溃疡为接种成功。两组家兔的发病情况见表2。睾丸接种组接种后第8天睾丸开始肿大变硬，13～16 d肿大最为明显，之后逐渐缩小，至接种后28 d所有家兔睾丸回缩，触诊未见肿大变硬。其中有1个睾丸发生溃疡，取组织液暗视野检查，可见到Tp。观察的2个月期间，未扪及腘窝淋巴结肿大。将家兔处死后对腘窝淋巴结［5］进行暗视野检查，未见到Tp，发病2个月内未发现其他部位出现皮损。

表2 梅毒螺旋体不同接种途径感染的两组家兔临床症状发生情况

背部皮内接种组接种后7 d，接种部位皮肤出现红肿，15～45 d皮损红肿最为明显，且出现溃疡，有3只家兔共12个接种点的皮肤发生溃疡，暗视野检查阳性，触诊呈软骨样硬度，触诊时未见家兔有任何不适反应。实验结束时仍有10个接种点皮损未消退，其中Ⅰ级皮损6个，Ⅱ级皮损4个。

睾丸接种组与背部皮内接种组临床症状最明显时间分别为（14.50±1.08）d及（29.00±10.30）d，两组比较，t=5.026，P=0.016。

三、RPR及TPPA结果

睾丸接种组接种后4 d RPR阳性，之后滴度逐渐升高，4 d后TPPA全部阳性。皮内接种组接种后12 d RPR开始阳性，之后滴度逐渐升高，7 d后TPPA全部阳性。两组家兔血清RPR滴度最高值分布见表3。经两独立样本秩和检验，P＜0.05，两组的滴度分布不同，睾丸接种组的滴度高于皮内接种组。

讨论

梅毒螺旋体不易在体外培养。将Tp接种于家兔睾丸中可以获得大量的Tp，将兔睾丸保存在液氮中数年仍有致病力［8］。

本研究采用相同菌量Tp接种于家兔的不同部位，发现睾丸接种组家兔临床症状最明显时间为13～16 d，与国外文献中报道的9～11 d不同［5］。家兔临床症状发生率为95%，睾丸溃疡发生率为5%，其他睾丸外观良好。大部分家兔睾丸可以发展到Ⅲ级水平。接种2个月后未见全身其他部位发生皮损。背部皮内接种组家兔临床症状发生率约为61.7%，其溃疡发生率为20%，较睾丸接种组高，皮损呈软骨样硬度，挤压皮损未见家兔有任何不适，推测皮损为无痛性溃疡，类似人类的一期梅毒硬下疳的表现。之后皮损逐渐好转，但观察2个月，未见二期梅毒表现，实验期间定期触诊皮内接种组家兔睾丸未见睾丸肿大。

表3 梅毒螺旋体不同接种途径感染的两组家兔血浆反应素环状卡片试验（RPR）最高滴度分布情况

与睾丸接种途径相比，皮下接种组家兔的RPR及TPPA出现的时间晚，RPR滴度低。可见通过睾丸接种途径能更快地刺激机体的免疫应答。睾丸接种组家兔在接种4 d后已有家兔RPR阳性，与人体RPR阳性出现时间相似［9］。

以上结果表明，两种接种途径对家兔的致病性有明显不同。睾丸接种13～16 d后，1个睾丸大约可孵育5×109Tp［5］，通过这种接种途径可在短时间内获得大量Tp。并且其免疫应答反应强烈，速度快。在进行药效评价时，有利于对比用药前后的免疫应答情况，了解药物的有效性。但其临床症状异于人类梅毒的表现，在一定程度上限制了此种模型的应用。背部接种Tp，临床表现类似于人类一期梅毒硬下疳的表现。在进行药效评价时，可模拟人类梅毒发病情况进行观察。但其临床症状发生率低，仅为61.7%，且其免疫反应强度不等，速度慢，不利于实验数据收集。

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Pathogenicity ofTreponema palliduminoculated through different routes in rabbits:a preliminary study

Wang Qi,Yin Yueping,Gong Kuanglong.Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China
Corresponding author:Yin Yueping,Email:yinyp@ncstdlc.org

ObjectiveTo observe clinical manifestations and immune responses in rabbit models of syphilis established by inoculation withTreponema pallidumthrough different routes.MethodsA total of 20 rabbits were randomly and equally divided into two groups:testis-inoculated group injected withTreponema pallidum（Tp）suspensions into the testes,back-inoculated group intracutaneously injected with Tp suspensions at six sites on the shaved back.All the rabbits

a single injection with the total injection amount of Tp（Nichols strains）being 2× 107in both groups.Clinical symptoms and immune responses were evaluated in both groups every other day.Statistical analysis was carried out by a two-samplet-test and rank sum test with the SPSS 20.0 software.ResultsOn day 8 after the inoculation,the testes of rabbits in the testis-inoculated group started to swell with induration,and the swelling was most severe during days 13-16.Afterwards,the testes gradually diminished,and returned to normal in size without swelling or hardening on day 28.No skin lesions occurred in the other sites in the testis-inoculated group within 2 months after the inoculation.Erythematous swelling occurred at inoculation sites on day 7 after inoculation in the backinoculated group,which was most obvious between days 15 and 45.Moreover,cartilage-like indurated ulcers were observed at 12 inoculation sites in 3 rabbits in the back-inoculated group,and dark-field examination of the ulcers showed the presence of Tp.There was a significant difference in the time required for the severity of lesions to peak between the testis-inoculated group and back-inoculated group（14.50±1.08 days vs.29.00±10.30 days,t＝5.02,P＜0.05）.Rank sum test showed significant differences in the distribution of highest RPR titers between the two groups（P＜0.05）,and RPR titers were higher in the testis-inoculated group than in the back-inoculated group.Conclusions The injection of Tp suspensions at different sites can cause different clinical symptoms and immune responses in rabbits.RPR turned positive earlier with a higher titer in the testis-inoculated group compared with the back-inoculated group.The clinical manifestations in the back-inoculated group were similar to those of chancre in primary syphilis in human.

Syphilis;Treponema pallidum;Disease models,animal;Rabbits

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.09.006

210042南京，中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所

尹跃平，Email：yinyp@ncstdlc.org

2015-01-15）

（本文编辑：颜艳）