芡种皮多酚提取物体外抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性研究

伍城颖，吴启南，王　　红，樊修和

（1.南京中医药大学附属中西医结合医院中药质量研究室，江苏南京210028；2.中国中医科学院江苏分院和江苏省中医药研究院中药代谢组研究室，江苏南京210028；3.江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏南京210023；4.南京中医药大学药学院，江苏南京210023）

芡种皮多酚提取物体外抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性研究

伍城颖1，2，吴启南3，4，*，王红4，樊修和4

（1.南京中医药大学附属中西医结合医院中药质量研究室，江苏南京210028；2.中国中医科学院江苏分院和江苏省中医药研究院中药代谢组研究室，江苏南京210028；3.江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏南京210023；4.南京中医药大学药学院，江苏南京210023）

通过体外实验研究了芡种皮多酚提取物对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的影响，并考察了其对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制动力学，研究结果显示：芡种皮多酚提取物在体外具有较强的抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的作用（IC50分别相当于生药浓度0.08 mg/mL和0.30 mg/mL），其抑制作用与浓度之间存在量效关系，二者的抑制类型均为可逆性的竞争性抑制剂。因此，芡种皮具有开发成辅助降糖的保健食品或药品的潜力，有很大的利用价值。

芡种皮，多酚提取物，α-葡萄糖苷酶，α-淀粉酶，抑制活性

芡（Euryale ferox Salisb.）为睡莲科（Nymphaeaceae）芡属（Euryale）唯一的种，在中国中部、南部各省均有种植，其主产区为江苏、山东、安徽、湖北、湖南等省［1］。芡种皮，又称芡实壳，据《本草纲目》记载，芡实壳可与芡实同用起涩精作用［2］。芡种皮重量约占芡种子重量的一半，在芡的生产过程中多作为燃料焚烧或直接废弃，对环境造成污染，也造成资源的极大浪费［3］。芡种皮富含酚类物质［4-5］，已有研究发现，芡种皮提取物能显著降低链脲佐菌素（STZ）诱发的糖尿病小鼠的血糖水平和血脂水平［6-8］，但尚未报道其降糖机制是否与抑制消化酶活性相关。

α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是影响淀粉等碳水化合物消化和吸收的关键糖苷水解酶，其主要作用是将淀粉、蔗糖等分解成葡萄糖、麦芽糖而被机体吸收。而α-葡萄糖苷酶抑制剂和α-淀粉酶抑制剂则可减缓淀粉等物质的降解，减少糖的吸收，从而降低餐后血糖，常用于二型糖尿病的治疗，常用的α-葡萄糖苷酶抑制剂药物有阿卡波糖、米格列醇等［9］。由于化学合成的α-葡萄糖苷酶抑制剂和α-淀粉酶抑制剂有副作用，目前从植物中寻找天然α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制剂已成为研究的热点。本研究拟对芡种皮多酚提取物体外对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性进行研究，以期为芡种皮的应用开发及芡资源的综合利用提供参考和依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

芡种皮2011年9月采集自苏州蒌葑群力村，经南京中医药大学药学院吴启南教授鉴定为睡莲科芡属芡（Euryale ferox Salisb.）的种皮，置阴凉通风处晾干后，粉碎过40目筛，备用；酿酒酵母α-葡萄糖苷酶（26.5 U/mg）和猪胰α-淀粉酶（50 U/mg） 美国Sigma公司；对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG） 上海宝曼生物科技有限公司；可溶性淀粉北京奥博星生物技术责任有限公司；阿卡波糖批号：130616，规格：50 mg/片，杭州中美华东制药有限公司；其余试剂均为分析纯，南京化学试剂有限公司；实验用水实验室自制超纯水。

Sartorius BT 125D型十万分之一电子分析天平北京赛多利斯仪器系统有限公司；KQ-500B超声波清洗仪昆山市超声仪器有限公司；MH-1型微量振荡器江苏海门市麒麟医用仪器厂；DHG-902电热鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司；HH-S型水浴锅巩义市英峪予华仪器厂；ELX800酶标仪和Synergy H1全功能酶标仪美国Bio-Tek公司；96孔酶标板美国Corning公司；微量移液器芬兰BIOHIT公司；SAGA-10TY实验室级超纯水器南京易普易达科技发展有限公司。

1.2实验方法

1.2.1样品的制备芡种皮多酚提取物参照文献方法［4-5］制备，用二甲基亚砜（DMSO）溶解，配制成相当于生药3 g/mL的溶液，于4℃储存。

1.2.2二硝基水杨酸（DNS）试剂的配制准确称取3，5-二硝基水杨酸0.63 g于100 mL烧杯中，加少量超纯水溶解后，加入2 mol/L的NaOH溶液26.2 mL，再加到50 mL含有18.2 g酒石酸钾钠的热水溶液中（温度不超过50℃），再加0.5 g苯酚和0.5 g无水亚硫酸钠，搅拌至溶解完全，冷却后用超纯水转移定容至100 mL棕色容量瓶中，充分混匀，室温放置一周后使用。

1.2.3α-葡萄糖苷酶活性抑制实验参考文献［10-12］方法并稍有改动。将样品溶液配制成分别相当于生药2.52×10-2、5.04×10-2、0.10、0.20、0.40、0.81 mg/mL的溶液；将阿卡波糖配制成浓度分别为4.69×10-2、9.38× 10-2、1.88×10-1、3.75×10-1、0.75、1.50、3.00、6.00 mg/mL的溶液。分别吸取pH7.0的磷酸盐缓冲液120 μL和不同浓度的样品溶液20 μL置于96孔板上，加入0.24 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液20 μL，混匀后于37℃反应10 min，再加入2.5 mmol/L的pNPG溶液20 μL，混匀，继续37℃反应10 min，最后加入0.2 mol/L的Na2CO3溶液80 μL终止反应，于405 nm波长处测定吸光度值，计算抑制率，并用Origin软件计算IC50值。以阿卡波糖为阳性对照，反应体系见表1。

表1　α-葡萄糖苷酶活性抑制实验反应体系Table 1　Reaction system of inhibition activity against α-glucosidase

1.2.4α-淀粉酶活性抑制实验参考文献［10，13］方法并稍有改动。将样品溶液配制成分别相当于生药2.93×10-1、5.86×10-1、1.17、2.34、4.69、9.38、18.75 mg/mL的溶液；将阿卡波糖配制成浓度分别为11.72×10-3、23.44×10-3、46.88×10-3、93.75×10-3、18.75×10-2、3.75× 10-1mg/mL的溶液。吸取不同浓度的样品溶液20 μL分别置于1.5 mL离心管内，加入3.75 U/mL的α-淀粉酶溶液20 μL，混匀后于37℃预热10 min，再加入0.5%的可溶性淀粉溶液40 μL，混匀后于37℃反应10 min，加入80 μL的DNS溶液终止反应，反应液置沸水浴中加热5 min后取出，于冰水浴中迅速冷却，测定540 nm波长处的吸光度值，计算抑制率，并用Origin软件计算IC50值。以阿卡波糖为阳性对照，反应体系见表2。

表2　α-淀粉酶活性抑制实验反应体系Table 2　Reaction system of inhibition activity against α-amylase

1.2.5对α-葡萄糖苷酶抑制作用的动力学实验参照文献方法［10］并稍有改动。酶浓度不变（0.24 U/mL），设置6个底物pNPG浓度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0 mmol/L），样品设置0.1 mg/mL和0.2 mg/mL两个浓度，分别吸取pH7.0的磷酸盐缓冲液120 μL和不同浓度样品20 μL置于96孔板上，加入0.24 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液20 μL，混匀后于37℃反应10 min，再分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0 mmol/L的pNPG溶液20 μL，混匀，37℃下反应，每隔5 min在405 nm波长条件下检测吸光度值，以底物浓度的倒数（1/S）为横坐标，以反应速度的倒数（1/V）为纵坐标，采用Excel软件绘制Lineweaver-Burk双倒数曲线，确定样品对α-葡萄糖苷酶的抑制类型。

为判断芡种皮多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制作用是否可逆，样品设0.1、0.2、0.4 mg/mL三个浓度，分别加入0.24 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液0、20、40、60、80、100 μL，补加pH7.0的磷酸盐缓冲液至等体积，再加入等量的底物pNPG反应，405 nm波长条件下检测吸光度值，以酶液的体积为横坐标，以反应速率为纵坐标，采用Excel软件绘制芡种皮多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学曲线。

1.2.6对α-淀粉酶抑制作用的动力学实验参照文献方法［10］并稍有改动。酶浓度不变（3.75 U/mL），设置3个底物淀粉浓度（0.5%、1.0%、2.0%），样品设46.88 mg/mL和93.75 mg/mL两个浓度，吸取不同浓度样品20 μL分别置于1.5 mL离心管内，各加入3.75 U/mL的α-淀粉酶溶液20 μL，混匀后于37℃预热10 min，再分别加入0.5%、1.0%、2.0%的可溶性淀粉溶液40 μL，混匀后于37℃反应，每隔5 min各浓度取出1支试管，加入80 μL的DNS溶液终止反应，反应液置沸水浴中加热5 min后取出，于冰水浴中迅速冷却，测定540 nm波长处的吸光度值，以底物浓度的倒数（1/S）为横坐标，以反应速度的倒数（1/V）为纵坐标，采用Excel软件绘制Lineweaver-Burk双倒数曲线，确定样品对α-淀粉酶的抑制类型。

为了判断芡种皮多酚对α-淀粉酶的抑制作用是否可逆，样品设46.88、93.75、187.50 mg/mL三个浓度，分别加入浓度为0、3.75、7.5、15 U/mL的α-淀粉酶溶液，再加入等量的淀粉溶液，反应后于540 nm波长条件下检测吸光度值，以酶液的浓度为横坐标，以反应速率为纵坐标，采用Excel软件绘制芡种皮多酚对α-淀粉酶的抑制动力学曲线。

2　结果与分析

2.1芡种皮多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

不同浓度的芡种皮多酚对α-葡萄糖苷酶活性的影响如图1所示，提取物对α-葡萄糖苷酶具有抑制作用。2.52×10-2mg/mL芡种皮多酚的抑制率为10.90%，随着芡种皮多酚浓度的升高，其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性也随之增加，当浓度为0.81 mg/mL时，抑制活性可达100%，其IC50为相当于生药0.08 mg/mL。从图2可以看出，阳性对照阿卡波糖在浓度为4.69×10-2mg/mL时，对α-葡萄糖苷酶的抑制率为7.01%，在6.00 mg/mL时抑制率达到84.93%，其IC50为0.52 mg/mL。因此，芡种皮多酚是较好的α-葡萄糖苷酶抑制剂，芡种皮多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制活性强于阿卡波糖。

图1　芡种皮多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制活性Fig.1　Inhibitory effects of Euryale ferox polyphenols extracts from seed coat on α-glucosidase

图2　阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制活性Fig.2　Inhibitory effects of acarbose on α-glucosidase

图3　芡种皮多酚对α-淀粉酶的抑制活性Fig.3　Inhibitory effects of Euryale ferox polyphenols extracts from seed coat on α-amylase

图4　阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制活性Fig.4　Inhibitory effects of acarbose on α-amylase

2.2芡种皮多酚对α-淀粉酶的抑制活性

不同浓度的芡种皮多酚对α-淀粉酶活性的影响如图3所示，提取物对α-淀粉酶具有抑制作用。2.93× 10-1mg/mL芡种皮多酚的抑制率为48.90%，随着芡种皮多酚浓度的升高，其对α-淀粉酶的抑制活性也随之增加，当浓度为18.75 mg/mL时，抑制率可达99.11%，提示芡种皮多酚具有较好的α-淀粉酶抑制活性。由图4可知，阳性对照阿卡波糖在浓度为11.72×10-3mg/mL时，对α-淀粉酶的抑制率为34.47%，在3.75×10-1mg/mL时抑制率达到96.17%。阿卡波糖抑制α-淀粉酶活性的IC50为0.02 mg/mL，芡种皮多酚提取物抑制α-淀粉酶活性的IC50为相当于生药浓度0.30 mg/mL，芡种皮多酚对α-淀粉酶的抑制活性弱于阿卡波糖。

2.3芡种皮多酚对α-葡萄糖苷酶抑制作用的类型

为确定芡种皮多酚提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制类型，在其他反应条件一定、改变底物浓度、添加不同浓度芡种皮多酚的条件下，测定酶促反应速率，以1/［S］为横坐标，以1/V为纵坐标，得到α-葡萄糖苷酶在不同浓度芡种皮多酚存在时的Lineweaver-Burk双倒数曲线，见图5。结果显示，加入不同浓度芡种皮多酚时，所得直线在纵轴上交于一点，即纵轴截距相等，随着样品浓度的增加，反应速率Vmax值基本保持不变；横轴截距随芡种皮多酚浓度的增加而增大，即米氏常数Km值增大，符合酶竞争抑制剂的作用特点，因此推测芡种皮多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型为竞争性抑制。

图5　不同浓度样品与α-葡萄糖苷酶反应的Lineweaver-Burk双倒数曲线Fig.5　Lineweaver-Burk plots of the reactions of α-glucosidase with samples

由图6可以看出，在测定酶活性体系中加入不同浓度的芡种皮多酚提取物后，所得的直线均通过原点，且直线的斜率随着芡种皮多酚浓度的增加而减少，说明芡种皮多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制作用是可逆的［14］。

图6　样品对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学曲线Fig.6　Kinetics curves of inhibition of α-glucosidase

2.4芡种皮多酚对α-淀粉酶抑制作用的类型

为确定芡种皮多酚提取物对α-淀粉酶的抑制类型，在其他反应条件一定、改变底物浓度、添加不同浓度芡种皮多酚的条件下，测定酶促反应速率，以1/［S］为横坐标，以1/V为纵坐标，得到α-淀粉酶在不同浓度芡种皮多酚存在时的Lineweaver-Burk双倒数曲线，见图7。结果显示，加入不同浓度芡种皮多酚时，所得直线在纵轴上的截距相等，随着样品浓度的增加，反应速率Vmax值基本保持不变；横轴截距随芡种皮多酚浓度的增加而增大，即米氏常数Km值增大，符合酶竞争抑制剂的作用特点，因此推断芡种皮多酚对α-淀粉酶的抑制作用为竞争性抑制。

图7　不同浓度样品与α-淀粉酶反应的Lineweaver-Burk双倒数曲线Fig.7　Lineweaver-Burk plots of the reactions of α-amylase with samples

由图8可知，在测定酶活性体系中加入不同浓度的芡种皮多酚提取物后，所得的直线均通过原点，且直线的斜率随着芡种皮多酚浓度的增加而减少，说明芡种皮多酚对α-淀粉酶的抑制作用是可逆的［14］。

图8　样品对α-淀粉酶的抑制动力学曲线Fig.8　Kinetics curves of inhibition of α-amylase

3　结论

本研究从资源利用的角度出发，对芡种皮多酚提取物进行了体外抑制消化酶活性的研究，实验结果证明，芡种皮多酚提取物具有较好的体外α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性，并且其活性与浓度有较好的量效关系，其抑制作用类型均为可逆性的竞争性抑制。芡种皮具有开发成辅助降糖的保健食品或药品的潜力，但其体内机制还需进一步深入研究。本研究结果为芡种皮开发功能食品或药品提供了一定的理论基础，对于提高芡的附加值和芡资源的有效利用具有重要意义。

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In vitro inhibitory effects of polyphenol extracts from Euryale ferox seed coat on α-glucosidase and α-amylase activities

WU Cheng-ying1，2，WU Qi-nan3，4，*，WANG Hong4，FAN Xiu-he4
（1.Department of Pharmaceutical Analysis，Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210028，China；2.Department of Metabolomics，Jiangsu Province Academy of Traditional Chinese Medicine and Jiangsu Branch of China Academy of Chinese Medical Sciences，Nanjing 210028，China；3.Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization，Nanjing 210023，China；4.School of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China）

The inhibitory effects of total polyphenols extracts from Euryale ferox seed coat against α-glucosidase and α-amylase were studied through the in vitro testing of inhibition rate and inhibition kinetics.The results showed that the total polyphenols exhibited strong inhibitory effects against α-glucosidase and α-amylase in vitro with dose-effect relationship and the IC50were 0.08 mg/mL and 0.30 mg/mL，respectively.The inhibition type was reversible and competitive inhibitor.In conclusion，Euryale ferox seed coat would be a potential source for a hypoglycemic functional food or medicine.

Euryale ferox Salisb.；polyphenol extracts；α-glucosidase；α-amylase；inhibitory effects

TS255.1

A

1002-0306（2015）16-0091-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.010

2014－10－14

伍城颖（1979-），女，博士，研究方向：中药资源开发与品质评价，E-mail：fangfeng1979@163.com。

吴启南（1963-），男，教授，研究方向：中药资源生产与品质评价，E-mail：qnwyjs@163.com。

“十二五”国家科技支撑计划项目（2011BAI04B06）；江苏高校优势学科建设工程资助项目；江苏省高等学校“中药资源化学研究”优秀科技创新团队（2011）项目；江苏省2013年度普通高校研究生科研创新计划项目（CXLX13_600）。