响应面分析法优化虾蛄盐溶蛋白快速提取工艺

周景丽，张坤生，任云霞

（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津300134）

响应面分析法优化虾蛄盐溶蛋白快速提取工艺

周景丽，张坤生*，任云霞

（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津300134）

为了缩短虾蛄盐溶蛋白的提取时间并得到最佳提取条件，在单因素实验的基础上，选出最佳辅助提取方式，并应用响应面法优化虾蛄盐溶蛋白的提取条件，确定最佳提取条件为：磁力搅拌时间为24 min，NaCl浓度为0.11 mol/L，提取液pH为6.36，料液比为1∶3 g/mL，此时虾蛄盐溶蛋白含量达22.46 mg/g，与预测值（22.71 mg/g）相差0.25 mg/g。

虾蛄，盐溶蛋白，快速提取，响应面法

虾蛄（Oratosquilla oratoria）属节肢动物门、甲壳纲、口足目、虾蛄科，俗称“螳螂虾”“琵琶虾”“虾爬子”等［1］。虾蛄肉质鲜嫩，分布广泛，营养丰富而受消费者喜爱［2］。目前对虾蛄中生物活性物质提取的研究主要集中在工艺提取［3-4］及活性成分的提取［5-6］。

Motoyama［7］及蔡秋凤［8］的研究表明，与其他虾类相比，口虾蛄肌肉粗提物中的肌肉蛋白极易发生分解，所以对虾蛄中盐溶蛋白的快速提取的研究显得尤为重要。占剑峰等［9］研究了对虾盐溶蛋白的提取条件对于热诱导凝胶特性的研究影响，但并未有效的缩短虾蛄盐溶蛋白的提取时间。王伟等［10］采用响应面法优化了鸭胸肉盐溶蛋白证明了响应面法的有效性。响应面法优化虾蛄盐溶蛋白的研究还未曾报道。

本文通过对虾蛄盐溶蛋白提取过程中影响因素的分析，在单因素实验的基础上，选取虾蛄盐溶蛋白提取的最佳辅助提取方式，并应用响应面分析法对虾蛄盐溶蛋白的提取条件进行优化，以提高虾蛄盐溶蛋白的含量，得到最佳的盐溶蛋白提取工艺，为虾蛄的进一步综合利用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

虾蛄购买于天津市金元宝滨海农产品交易市场；考马斯亮蓝G250天津市科密欧化学试剂开发中心；牛血清白蛋白（BSA） Sigma试剂公司；无水乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠天津市北方天医化学试剂厂；氯化钠、85%磷酸天津市风船化学试剂科技有限公司；化学试剂均为分析纯。

FA2004A型电子天平上海精天仪器有限公司；IKAT10型高速组织匀浆机德国IKA公司；Avanti J-E型高效离心机美国贝克曼库尔特有限公司；UV-7504型紫外可见分光光度计上海欣茂仪器有限公司；EL20型实验室pH计梅特勒-托利多仪器有限公司；磁力搅拌器天津市欧诺仪器仪表有限公司；JY92型超声波细胞粉碎机浙江宁波新艺超声设备有限公司；MAS-1型微波萃取仪上海新仪微波化学科技有限公司。

1.2实验方法

1.2.1预处理及虾蛄肉盐溶蛋白提取将购买的鲜活虾蛄分装于PP750mL塑料餐盒（长约17.5 cm，宽约12 cm，高约5.5 cm）中，每盒分装约0.5 kg，-18℃以下冻藏，使用前于4℃下解冻。参考SUN［11］和邱春强［12］的方法，改进如下：将解冻后的虾蛄去头，去甲壳，去净肠腺及虾黄，将虾蛄肉与一定浓度的盐溶液按一定比例混合后，在10000 r/min的转速下用高速组织匀浆机搅成肉浆状，并采用适当的辅助提取方法提取适当时间后，在4℃10000 r/min下离心10 min，收集上清液，该上清液即为盐溶蛋白，用去离子水稀释上清液后测定蛋白质浓度。

1.2.2虾蛄盐溶蛋白的测定参考曹建康［13］的方法进行虾蛄盐溶蛋白含量的测定。

1.2.3单因素实验设计虾蛄盐溶蛋白提取过程中，影响提取率的主要因素为辅助提取方式、提取时间、NaCl浓度、提取液pH、料液比。

取虾蛄肉5 g，加入4倍体积的pH为6.5的磷酸盐缓冲液，并要求NaCl浓度0.10 mol/L。在10000 r/min的转速下均质30 s，采用水浴（温度为30℃）、磁力搅拌（搅拌速度600 r/min，搅拌温度4℃）、超声波（功率设定为20 W，超声时间10 s，间隙时间10 s），微波（功率设定为20 W）4种方法辅助提取，分别提取5 min、10 min。将匀浆液用纱布过滤，在10000 r/min的转速下离心10 min，收集上清液，用去离子水稀释上清液后测定蛋白质浓度，选取蛋白含量最高的作为最优辅助提取方式。

以蛋白含量为指标，利用最优辅助提取方式，在NaCl浓度为0.10 mol/L，提取液pH为6.5，料液比为1∶4，提取时间为30 min条件下确定最佳提取时间（10、20、30、40、50 min）、NaCl浓度（0.02、0.06、0.10、0.14、0.18 mol/L）、提取液pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、料液比（1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6）g/mL

1.2.4响应面实验设计根据Box-Behnken中心设计原理［14］，应用Design Expert 8.0.4软件进行实验设计。根据单因素实验结果，以磁力搅拌时间、NaCl浓度、提取液pH、料液比四个因素为自变量，并以-1、0、1分别代表自变量的低、中、高水平，虾蛄盐溶蛋白含量为响应值设计实验，设计29个实验点，其中24个析因点，5个零点，实验因素见表1。

表1　响应面实验因素水平Table 1　The levels and factors of response surface experimental

1.2.5最佳条件的验证实验利用Design Expert 8.0.4软件获得了各个因素的最佳条件组合，结合实际可操作性进行适当修正，在修正后的条件下进行三次验证实验。

1.2.6数据处理实验用设计分析软件为Design Expert 8.0，采用SPSS 16.0对数据进行处理和分析。

2　结果与讨论

2.1单因素实验及分析

2.1.1辅助提取对虾蛄盐溶蛋白提取的影响水浴、微波、超声波及磁力搅拌辅助提取对虾蛄盐溶蛋白提取的影响见图1。由图1可以看出，在提取时间一定时，磁力搅拌辅助提取要明显优于其他三种辅助提取方式；辅助提取方式一定时，在辅助提取时间为10～50 min内，随着提取时间的延长，超声波辅助提取与磁力搅拌辅助提取蛋白增加的速度优于静置提取。磁力搅拌辅助提取的优点是可以在4℃下操作，且在提取过程中没有温度的升高，不会影响虾蛄中的蛋白质活性成分。而超声波及微波辅助提取在室温下操作，实验结果显示功率设为20 W，提取5 min，温度分别可达39℃和42℃，提取10 min，温度可达53℃和60℃。温度可以影响虾蛄中蛋白质的空间结构，加热破坏了肌原纤维蛋白的空间结构，使巯基暴露出来，被氧化成二硫键，导致蛋白的完全变形和聚集［15］。随着温度上升，变性速度加快［16］。比较而言，磁力搅拌法不产生高温，设备要求简单，操作简单，是一种值得推广的，具有应用前景的辅助提取方式。

图1　辅助提取方式与蛋白含量的关系Fig.1　Effect of assisted extraction methods on protein content

图2　磁力搅拌时间与蛋白含量的关系Fig.2　Effect of magnetic stirring time on protein content

2.1.2磁力搅拌时间对虾蛄盐溶蛋白提取的影响不同磁力搅拌时间对虾蛄盐溶蛋白提取的影响见图2。由图2可以看出，磁力搅拌时间在10～20 min时，蛋白含量随搅拌时间的延长而明显提高，说明蛋白质浸出的速度较快；在20～50 min，随搅拌时间的延长，蛋白浓度增加的速度缓慢，说明盐溶蛋白已基本溶出。出现上述现象的原因是前者的蛋白质渗透压高于后者［17］，后者蛋白质已基本溶出。

2.1.3NaCl浓度对虾蛄盐溶蛋白提取的影响不同的NaCl浓度对虾蛄盐溶蛋白提取的影响见图3。由图3可以看出，NaCl浓度在0.1 mol/L时，蛋白含量最高；NaCl浓度在0.02～0.1 mol/L范围内时，蛋白含量随NaCl浓度升高而逐渐增大；NaCl浓度在0.1～0.18 mol/L范围内时，蛋白含量随NaCl浓度升高而逐渐减小。原因可能是NaCl浓度在0.02～0.1 mol/L范围内时，NaCl对蛋白质的作用主要表现为盐溶作用，会增加蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在溶液中的溶解度增大；NaCl浓度在0.1～0.18 mol/L范围内时，蛋白质发生盐析，不利于蛋白质的溶解［18］。

图3　NaCl浓度与蛋白含量的关系Fig.3　Effect of extraction solution concentration of NaCl on protein content

2.1.4提取液pH对虾蛄盐溶蛋白提取的影响不同的提取液pH对虾蛄盐溶蛋白提取的影响见图4。由图4可以看出，在pH为6.5时，蛋白提取效果最佳；pH在5.5～6.5范围内时，蛋白含量随pH升高而逐渐增大；pH在6.5～7.5范围内时，蛋白含量随pH升高而逐渐减小。这是由于蛋白质在等电点以上或以下的pH时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而相互排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大［19］。

图4　提取液pH与蛋白含量的关系Fig.4　Effect of extraction solution pH value on protein content

2.1.5料液比对虾蛄盐溶蛋白提取的影响不同的料液比对虾蛄盐溶蛋白提取的影响见图5。由图5可以看出，料液比在1∶2～1∶3时，蛋白含量随料液比的提高而明显提高；在1∶3～1∶6，随搅拌时间的延长，蛋白浓度增加的速度缓慢。料液比对蛋白质溶解度的影响主要是由于在蛋白质表层形成的水化层使蛋白质颗粒彼此不能接近，因此在一定范围内，溶剂量越大，蛋白质溶液的稳定性越好，溶解度越大［20］。但料液比增加到一定程度时，蛋白质已基本溶出，蛋白含量趋于平缓。

图5　料液比与蛋白含量的关系Fig.5　Effect of material-liquid ratio on protein content

2.2响应面优化实验结果分析

响应面实验设计及结果见表2。

根据表2的结果，通过多元回归和逆向消除获得二次多项回归模型，二次响应曲面模型拟合于方程：

Y=23.4+0.36X1+0.3X2+0.12X3-1.2X4+0.2X1X2-0.12X1X3+0.83X1X4-0.06X2X3+0.62X3X4-1.47X12-0.27X22-0.26X32-0.86X42

回归模型的显著性检验和方差分析见表3。由表3可知，该模型的F值为16.32，p＜0.0001，表明模型极显著。失拟项的F值为3.33，p=0.1289＞0.05，故失拟项不显著，模型选择合适。回归模型决定系数R2= 0.9423，矫正决定系数R2Adj=0.8845，说明回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以通过该回归方程确定虾蛄盐溶蛋白的最佳提取工艺条件。

方差分析表明，磁力搅拌时间对蛋白含量的影响显著，NaCl浓度、料液比对蛋白含量的影响极显著，从各变量显著性检验p值的大小，可以看出影响虾蛄盐溶蛋白含量的各因素按大小排序依次为：料液比＞NaCl浓度＞磁力搅拌时间＞提取液pH。磁力搅拌时间×料液比、提取液pH×料液比、磁力搅拌时间平方项、NaCl浓度平方项、提取液pH平方项、料液比平方项对蛋白含量的影响极显著。

根据回归方程，作出三维响应面图和等高线图。三维响应面图可以显示响应面的变化趋势和最大值点［21］。等高线图可以直观反映两变量交互作用的显著程度，圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形表示两因素交互作用显著［22］。

由图6～图11可以看出，磁力搅拌时间×料液比、提取液pH×料液比极显著，表现为等高线图形较扁平，其他因素间的交互作用不显著。由图8可以看出，磁力搅拌时间与料液比对蛋白含量均有影响，二者均呈二次曲线形式，随着磁力搅拌时间的延长与料液比的增大，蛋白含量先增加后减小，说明磁力搅拌时间与料液比之间有极显著的协同作用，二者的协同作用可能会影响蛋白含量。由图11可以看出，提取液pH与料液比对蛋白含量均有影响，随着提取液pH的增大，蛋白含量逐渐下降，随着料液比的增加，蛋白含量先增加后减小。

表2　响应面实验设计与结果Table 2　Design and results of response surface experiment

图6　磁力搅拌时间和NaCl浓度的响应面Fig.6　Response surface plot of magnetic stirring time and extraction solution concentration of NaCl

表3　回归模型方差分析Table 3　Variance analysis of regression model

图7　磁力搅拌时间和提取液pH的响应面Fig.7　Response surface plot of magnetic stirring time and extraction solution pH

图8　磁力搅拌时间和料液比的响应面Fig.8　Response surface plot of magnetic stirring time and material-liquid ratio

图9　NaCl浓度和提取液pH的响应面Fig.9　Response surface plot of extraction solution concentration of NaCl and extraction solution pH

图10　NaCl浓度和料液比的响应面Fig.10　Response surface plot of extraction solution concentration of NaCl and material-liquid ratio

图11　提取液pH和料液比的响应面Fig.11　Response surface plot of extraction solution pH and material-liquid ratio

2.3最佳条件的验证实验

利用Design Expert 8.0.4软件获得了各个因素的最佳条件组合为：磁力搅拌时间为24.14 min，NaCl浓度为0.11mol/L，提取液pH为6.36，料液比为1∶2.98 g/mL，蛋白含量响应值为22.71 mg/g。考虑到实际的可操作性，将以上最佳条件修正为：磁力搅拌时间为24 min，NaCl浓度为0.11 mol/L，提取液pH为6.36，料液比为1∶3 g/mL，在此条件下进行三次实验，得到虾蛄盐溶蛋白含量的平均值为（22.46±0.78）mg/g。

3　结论

本实验利用实验设计软件Design Expert 8.0.4，通过二次回归设计得到了蛋白含量与磁力搅拌时间、NaCl浓度、提取液pH、料液比四个自变量关系的回归模型，模型表明磁力搅拌时间对蛋白含量的影响显著，NaCl浓度、料液比、磁力搅拌时间×料液比、提取液pH×料液比对蛋白含量的影响极显著，并得到虾蛄盐溶蛋白的最佳提取工艺条件：磁力搅拌时间为24 min，NaCl浓度为0.11 mol/L，提取液pH为6.36，料液比为1∶3 g/mL。此时虾蛄盐溶蛋白含量可达（22.46±0.78）mg/g。

［1］盛福利，曾晓起，薛莹，等.青岛近海口虾蛄的繁殖及摄食习性的研究［J］.中国海洋大学学报，2009，39（S1）：326-332.

［2］刘勤生，陈庆森，王泽帅，等.虾蛄冷藏条件的研究［J］.食品科学，2008，29（5）：431-434.

［3］曹根庭，周涛，裘迪红，等.虾蛄蛋白酶法水解条件的研究［J］.浙江水产学院学报，1996，15（1）：49-55.

［4］李云涛，陈博，马剑茵.虾蛄肉酶法制备抗氧化肽的工艺优化和活性研究［J］.海洋与湖沼，2014，45（2）：335-339.

［5］王明艳，夏超，喻川，等.响应面法优化黑斑口虾蛄头中多不饱和脂肪酸提取条件的研究［J］.淮海工学院学报，2013，22（1）：83-87.

［6］顾帝水，孔霞，陈锦，等.口虾蛄提取物对体外人鼻咽癌细胞转移潜能的影响［J］.时珍国医国药，2010，21（2）：360-361.

［7］Motoyama K，Suma Y，Ishizaki S，et al.Identification of tropomyosins as major allergens in antarctic krill and mantis shrimp and their amino acid sequence characteristics［J］.Marine Biotechnology，2008，10（6）：709-718.

［8］蔡秋凤，王锡昌，刘光明，等.口虾蛄主要过敏原原肌球蛋白的免疫活性［J］.水产学报，2010，34（3）：415-421.

［9］占剑峰，黄文.对虾肉盐溶蛋白的提取条件对于热诱导凝胶特性的影响研究［J］.食品科技，2008，33（11）：126-129.

［10］王伟，汪梦非，姚遥，等.响应面法优化鸭胸肉盐溶蛋白的提取工艺［J］.食品工业科技，2013，34（14）：259-262.

［11］Jingxin Sun，Zhen Wu，Xinglian Xu，et al.Effect of peanut protein isolate on functional properties of chicken salt-soluble proteins from breast and thigh muscles during heat-induced gelation［J］.Meat Science，2012，91：88-92.

［12］邱春强，张坤生，任云霞.超高压和瓜尔胶对鸡肉盐溶蛋白凝胶的影响［J］.核农学报，2014，28（3）：433-439.

［13］曹建康，姜微波，赵玉梅.果蔬采后生理生化实验指导［M］.北京：中国轻工业出版社，2007：68-70.

［14］ALLAIX D L，CARBONE V I.An improvement of the response surface method［J］.Structural Safety，2011，33（2）：165-172.

［15］Ko W C，Yu C C，Hsu K C.Changes in conformation and sulfhydryl groups of tilapia actomyosinby thermal treatment［J］. LWT-Food Science&Technology，2007，40（8）：1316-1320.

［16］范三红，刘晓华，胡雅喃，等.加热处理对鱼肉蛋白质理化特性的影响［J］.食品工业科技，2014，35（12）：104-107.［17］王伟，汪梦非，姚遥，等.响应面法优化鸭胸肉盐溶蛋白的提取工艺［J］.食品工业科技，2013，34（14）：259-262.

［18］谭秀山，赵兴，黄现青.鸡肉蛋白质提取条件的优化［J］.食品工业，2013，34（5）：56-58.

［19］王镜岩，朱圣庚，徐长法.生物化学［M］.北京：高等教育出版社，2002：305.

［20］陈申如，张其标，倪辉.酸法提取鲢鱼鱼肉蛋白质技术的研究［J］.海洋水产研究，2004，25（5）：61-64.

［21］Muralidhar R V，Chirumamila R R，Marchant R，et al.A response surface approach for the comparison of lipade production by Candida cyylindracea using two different carbon sources［J］. Biochem Eng，2001（9）：17-231.

［22］邹明辉，李来好，郝淑贤，等.响应面法优化南美白对虾虾仁无磷保水工艺［J］.食品科学，2010，31（20）：159-165.

Optimization of salt-soluble protein from oratoria by response surface methodology

ZHOU Jing-li，ZHANG Kun-sheng*，REN Yun-xia
（Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

To optimize the fast extraction condition for the oratosquilla oratoria salt-soluble protein，the best assisted extraction methods was obtained on the basis of single-factor investigation.The optimize extraction conditions were as follow：extraction solution pH of 6.36，extraction solution concentration of NaCl was 0.11 mol/L，material to water ratio at 1∶3，and magnetic stirring extraction-duration of 24 min.The salt-soluble protein content could reach 22.46 mg/g，and the theory predicted value（22.71 mg/g）differs by 0.25 mg/g.

oratosquilla oratoria；the salt-soluble protein；the fast extraction；response surface methodogy

TS201.2

B

1002-0306（2015）16-0279-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.048

2014－12－16

周景丽（1990-），女，硕士研究生，研究方向：食品加工与贮藏，E-mail：zhoujingli1110@126.com。

张坤生（1957-），男，博士，教授，研究方向：食品加工与贮藏，E-mail：zhksheng@tjcu.edu.cn。

国家科技支撑计划项目（2012BAD37B06-07）。