三种ELISA试剂盒检测猪流行性乙型脑炎病毒血清IgG抗体比较

马淑娟，熊益权，张琼花，周军华，李 杏，郑雪燕，蒋丽娜，钟雪珊，陈少威，陈 清

流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis，JE，简称乙脑），是导致人类中枢神经系统损害的自然疫源性疾病，其病原体为流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV，简称乙脑病毒）。乙脑的主要传染源是猪。由于仔猪出生率高，对乙脑无免疫力，受带毒蚊虫叮咬后几乎100%受感染，且受感染时间比人早2～4周[1]。监测猪乙脑病毒感染情况和血清抗体水平，可对人乙脑流行情况做出预测，是制定预防和控制乙脑流行措施的重要依据。

猪乙脑病毒感染状况监测多采用血清学检测方法[2]，微量中和试验是国际公认的乙脑病毒血清学检测金标准[3]，但该试验操作复杂且耗时。ELISA方法具备快速、高效、低廉、特异性强、灵敏度高、简便、无需无菌操作，可同时检测多份血清样品等优点被广泛采用[2]。通过文献检索发现，国外大多采用研究者自行建立的ELISA方法进行猪血清乙脑病毒IgG抗体的检测[4]，而国内较多使用商品化试剂盒。

目前国内市场上的商品化猪乙脑病毒血清IgG抗体ELISA检测试剂盒品牌众多，给应用者选择带来一定的困难。我们通过文献检索，选择应用最多的3种ELISA试剂盒[5－13]，以微量中和试验为金标准，对其效度和信度进行评价，旨在为猪乙脑病毒感染的监测推荐较为稳定可靠的试剂盒。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 待检血清 待检血清为2013年1月和3月取自广州某屠宰场的90份6－8月龄猪血样品，经3 000r／min离心15min，取血清混匀分装，一式4份，－80。C保存备用。

1.1.2 ELISA检测试剂盒 猪乙脑病毒血清IgG抗体ELISA检测试剂盒分别购自武汉科前动物生物制品有限责任公司（以下简称为Keqian）（生产批号为130101，有效期为10个月）、深圳绿诗源生物技术有限公司（以下简称为Lvshiyuan）（生产批号为20121210、20130401，有效期为6个月）和东莞天辰生物科技有限公司（以下简称为Tianchen）（生产批号为D201301166、D20130302，有效期为12个月）。

1.1.3 乙脑毒株和阳性血清 乙脑病毒NaK株，由本实验室保存；猪乙脑病毒IgG抗体阳性血清购自科前动物生物制品有限责任公司（生产批号为121005）。

1.2 血清学检测

1.2.1 ELISA各试剂盒检测均严格按照说明书进行操作。主要步骤有：样本稀释、加样、温育、洗板、加酶标记物、温育、洗板、显色、终止和结果测定。90份待检样本血清每样平行做两孔，结果判定时取两孔平均值，每次结果取3次平行测量的吸光度平均值。结果判定标准参照各自说明书：①Keqian：S／P（样品OD值／阳性对照 OD值）≥0.21为阳性，S／P＜0.21为阴性；②Lvshiyuan：S＞0.4为阳性，S在0.2～0.4之间为可疑阳性，S＜0.2为阴性；③Tianchen：S／P≥0.18为阳性，0.15≤S／P＜0.18为可疑阳性，S／P＜0.15为阴性。

1.2.2 中和试验 按照中华人民共和国卫生行业标准WS214－2008进行，先用乙脑病毒NaK株感染敏感的BHK－21细胞测定病毒50%致细胞病变量（TCID50）以确定进行中和试验的病毒用量。然后使用50～100TCID50／50μL（允许范围为32～320TCID50）的乙脑病毒进行中和试验，主要步骤有：灭活待检血清，倍比稀释血清并与试验浓度病毒等体积混合，设立对照，37。C水浴1h，接种至96孔单层BHK－21细胞板，37。C、5%CO2培养箱孵育1h后每孔补加50μL 5%维持液放置于培养箱继续培养。病毒接种48h后，逐日观察细胞病变，取接种后5～7d结果计数中和指数并记录结果，猪血清乙脑病毒IgG中和抗体滴度≥1∶10判定为猪乙脑病毒感染阳性[4，14]。

1.3 统计学分析 使用SPSS13.0进行数据分析，采用灵敏度和特异度对试剂盒的检测效度进行评价；采用Friedman秩和检验、Wilcoxon符号秩和检验分析3种试剂盒和中和试验阳性率的差异；采用κ系数评价试剂盒检测结果与中和试验的吻合度；采用配对t检验对3种试剂盒内部一致性进行分析。

2 结 果

2.1 检测结果 3种ELISA试剂盒及金标准中和试验分别完成了90份待检猪血清乙脑病毒IgG抗体的检测，按照各自的判定标准得出结果，见表1。

表1 3种ELISA试剂盒及中和试验检测90份猪血清的结果Tab.1 Results of 90swine sera detected by three kinds of ELISA kits and serum neutralization test

2.2 3种试剂盒的效度评价 以中和试验为金标准，对3种试剂盒进行灵敏度和特异度的评价，结果见表2、3。

2.3 3种试剂盒与中和试验符合情况比较 3种试剂盒与中和试验检测结果符合情况比较见表3、4。

2.3 试剂盒内部一致性分析 Keqian，Lvshiyuan，Tianchen 3种ELISA试剂盒对90份血清样本均进行了两平行复孔的检测，统计量见表5，结果显示复孔间OD值相近，均数差在0.008以内。同一试剂盒复孔间进行配对t检验，显示3种试剂盒两平行复孔检测的总体平均差异均没有统计学意义（P＞0.05）。两平行孔之间均有较高的相关性，Keqian，Lvshiyuan，Tianchen的相关系数分别为0.977，0.962和0.998（见表5），说明3种试剂盒均具有较高的稳定性。

表2 3种ELISA试剂盒与中和试验检测猪血清乙脑病毒抗体结果比较Tab.2 Comparison of three kinds of ELISA kits and serum neutralization test for detection of swine serum antibodies against JEV

表3 3种ELISA试剂盒的检测效度评价Tab.3 Validity of three kinds of ELISA kits for detection of swine serum antibodies against JEV

表4 3种试剂盒与中和试验检测结果多重比较结果及κ系数Tab.4 Comparison of kappa coefficient between three kinds of ELISA kits and serum neutralization test for detection of swine serum antibodies against JEV

表5 3种试剂盒检测同一样本两平行复孔OD值的配对t检验Tab.5 Paired t－test of the OD values of two parallel wells of the same sample detected by three kinds of ELISA kits

3 讨 论

选用的3种ELISA试剂盒阳性检出率均高于中和试验，中和试验的阳性检出率为34.4%（31／90），Keqian阳性检出率相对最高为50.0%（45／90），Lvshiyuan 阳 性 检 出 率 为 47.8% （43／90），Tianchen阳性检出率为38.9%（35／90）。这说明ELISA方法灵敏度较高，而且该法操作简单，适用于常规猪乙脑感染情况的监测。但是，目前国内商品化猪乙脑病毒血清IgG抗体检测试剂盒的检测结果差异较大，有必要进行系统的诊断试验评价。与金标准中和试验比较，3种试剂盒检测结果与中和试验均有一定差异，Tianchen的结果与中和试验比较吻合度较高（κ＝0.63），Keqian和 Lvshiyuan的差异较大，Keqian和Lvshiyuan与中和试验结果吻合度为0.57和0.04；后者的这一情况可能同该试剂盒的可疑阳性判定范围大有关，建议适当压缩可疑阳性的范围，减少重复检测。

试剂盒内部一致性分析显示3种试剂盒均有很好的稳定性。其中Keqian的灵敏度最高（90.32%），阴性似然比最低（0.14），说明其检测结果阴性时为真阴性的概率最大，可用于排除试验。Tianchen的灵敏度较高，为83.87%，且其特异度也较高，为79.66%，阳性似然比最高（4.12），说明其检测结果阳性时为真阳性的概率最大，阴性似然比为0.20，说明检查结果阴性时为真阴性的概率也较大，当检测同时需要较高的灵敏度和特异度时，可考虑首选该试剂盒。Lvshiyuan的灵敏度和特异度均较低，分别为41.94%和16.95%，检测效度相对较差，阳性似然比（0.50）明显低于其他两个试剂盒，表明该试剂盒应进一步加以改进。

本研究发现国内市场上这3种试剂盒虽同为检测猪血清乙脑病毒IgG抗体的ELISA试剂盒，但检测结果差异显著，可能是因为国产的商品化试剂盒采用包被粗制全病毒抗原的间接ELISA法，实验的本底较高[15]，质量差异大，导致检测的敏感性不一。鉴于我国家猪饲养数量大，更新速率快，乙脑病毒的感染率高[5－8，13]。商品化 ELISA 试剂盒快速、高效、低廉、无需无菌操作、有较高灵敏度和特异度等优点，是乙脑作为《中华人民共和国动物防疫法》规定养猪场监测疫病的理想血清学监测方法。商品化ELISA试剂盒检测效度将直接影响常规监测结果的报道，关系到国内猪乙型脑炎病毒感染现状的评估及猪乙型脑炎疫苗保护效果的评价。笔者认为国家食品药品监督管理局应严格规范商品化猪乙脑病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒的上市标准，并定期监测试剂盒的检测效能，一定程度上保证检测结果的真实可靠。

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