健脾补土方对脑缺血/再灌注损伤大鼠NF-κB和IκBα蛋白表达水平的影响

付小金，刘旺华*，李 花，金朝晖，周小青

（1.湖南中医药大学中医诊断学研究所，湖南 长沙410208；2.湖南中医药大学中医学院，湖南 长沙410208；3.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007）

脑缺血/再灌注损伤是一个快速级联反应过程，是由能量代谢障碍、兴奋性氨基酸中毒、氧自由基生成增多、细胞内钙超载、炎症反应和细胞凋亡等多种因素参与的病理过程[1]，而影响它的主要病理机制是炎症反应和细胞凋亡。 核因子-κB（nuclear factor-κappa B，NF-κB） 信号通路可调控多种炎症因子及凋亡基因的转录，参与炎症级联反应及细胞凋亡等病理过程[2]。 目前，已有大量实验研究表明，通过抑制NF-κB 信号通路， 下调相关因子表达，可减轻脑缺血/再灌注损伤。实验前期研究表明健脾补土方对脑缺血/再灌注损伤神经功能具有保护作用，其机制可能与抑制MMP-2[3]和MMP-9 表达，减少层黏连蛋白降解[4]，抑制无菌性炎症的产生，从而维护基底膜的完整性保护血脑屏障有关，但其具体机制还不清楚。 本实验通过研究健脾补土方对大鼠脑缺血后炎症因子的上游因素NF-κB、NF-κB 抑制蛋白α(inhibitor of NF-κB α，IκBα)表达的影响，探讨健脾补土法对脑缺血/再灌注损伤大鼠神经保护作用的机制。

1 材料和方法

1.1 动物

健康清洁级SD 雄性大鼠120 只， 体质量（240±20）g， 由湖南斯莱克景达实验动物有限司提供，动物许可证号：SCXK（湘）2013-0004，动物合格证号：NO43004700006140。

1.2 药物与试剂

健脾补土方以经典四君子汤为基础配伍，组方：人参15 g，白术12 g，茯苓10 g，黄芪15 g，山药12 g，薏苡仁12 g，炙甘草6 g。 药物购自湖南中医药大学第一附属医院。 药液制备： 清水浸泡30 min 后，第1 次加6 倍水煎煮40～60 min，第2次加4 倍水煎煮30 min， 将2 次滤药液混合并水浴浓缩至生药浓度为1 g/mL，灭菌分装，4 ℃冷藏备用。依达拉奉注射液（吉林省博大制药有限公司，规格：10 mL/15 mg）。 10%水合氯醛、 多聚甲醛系天津市科密欧化学试剂有限公司产品，一抗兔抗大鼠NF-κB/p65（10745-1-AP）、兔抗大鼠IκBα（SC-324882）、兔抗大鼠β-actin （600008-1）系Proteintech 公司产品， 其他试剂由上海国药生物公司生产。

1.3 主要仪器

164-5050 电泳仪（美国Bio-rad 公司），DYCZ-24EN 电泳槽（北京六一厂），DYCZ-40A 转膜仪（北京六一厂），BX51 光学显微镜 （日本OLYMPUS 公司），KD-2258 轮转切片机（科迪仪器设备公司）。

1.4 动物分组及给药

将120 只大鼠随机分为6 组，每组20 只，分别为假手术组（蒸馏水，灌胃）、模型组（蒸馏水，灌胃）、依达拉奉组(3.2 mg/kg，腹腔注射)、健脾补土方小剂量组(下称小剂量组，3.69 g/kg，灌胃)、健脾补土方中剂量组(下称中剂量组，7.38 g/kg，灌胃)、健脾补土方大剂量组(下称大剂量组，14.76 g/kg，灌胃)，假手术组、模型组给予等体积蒸馏水，剂量根据人临床剂量按动物体表面积换算。 模型成功24 h 后开始给药，每日1 次，每天相同时间连续给药7 d。

1.5 动物模型制备及评价

采用改良Longa 等[5]的线栓法建立大脑中动脉闭塞模型，于缺血2 h 后进行再灌注。 假手术组除不插线外，其余步骤同模型组。 参照经典的Longa 5级4 分法[4]，于大鼠完全清醒后，采用双盲法对其神经功能缺损评分。 0 分：无神经功能缺损症状；1 分：不能完全伸展右前肢， 提尾悬吊时右前肢屈曲；2分：爬行时向右转圈，追尾；3 分：爬行时向右倾倒；4分：不能自主行走，意识障碍。 评分为1～3 分者评定为成功模型，可纳入研究对象。 不成功者剔除，补充动物，保证每组动物20 只。

1.6 标本采集及处理

灌注后第7 天，每组随机取大鼠10 只。 用10%水合氯醛腹腔注射麻醉， 固定后打开胸腔暴露心脏，经左心室快速灌注生理盐水200 mL，至流出液变清，再缓慢灌注4%多聚甲醛300 mL，灌注固定30 min 至肝脏变硬白后断头取脑， 置于4%多聚甲醛固定，-4 ℃保存备用。 每组另外10 只大鼠麻醉后迅速断头取脑， 在冰上小心剥离软脑膜，取缺血区大脑皮质组织， 用冰PBS 洗涤后放入冻存管，-80 ℃保存备用。

1.7 指标检测

1.7.1 神经功能评分 参照Longa 5 级4 分法[4]，各组动物在手术完全清醒后和灌注后第7 天处死前2 h 进行评分。

1.7.2 HE 染色 脑组织置于4%多聚甲醛固定24 h 后，石蜡包埋，行5 μm 厚的连续冠状切片，HE染色，高倍光学显微下观察神经细胞改变。

1.7.3 Western blot RIPA 提取总蛋白，BCA 法测定蛋白质浓度。 行10% SDS-PAGE 凝胶电泳分离，蛋白上样量50～100 μg。 湿式转膜后脱脂牛奶封闭1 h，滴加入相应的NF-κB/p65(1∶500)、IκBα（1∶200）及内参β-action（1∶4 000）一抗，4 ℃孵育过夜；滴加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶3 000），室温孵育45～60 min；ECL 显色，X 线底片曝光。 Quantity one专业图像分析软件对条带行灰度扫描分析，以样品条带灰度值/相应内参灰度值表示目的蛋白的表达。

1.8 统计学分析

应用SPSS 22.0 统计软件进行分析， 所有数据均采用“±s”表示。 组间两两比较方差齐者用LSD法检验，方差不齐者用Dunnet，s T3 法检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分分数比较

与假手术比较， 模型组神经功能缺损评分显著增加，差异有显著统计学意义(P＜0.01)；与模型组比较，依达拉奉组、健脾补土方大、中、小剂量组神经功能缺损评分均明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），且依达拉奉组、健脾补土方小、中、大剂量组组间差异无统计学意义(P＞0.05)。 见表1。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分分数比较 （±s，n=20）

表1 各组大鼠神经功能缺损评分分数比较 （±s，n=20）

注：与假手术组比较△△P＜0.01；与模型组比较#P＜0.05，##P＜0.01。 下表同。

组 别假手术组模型组依达拉奉组小剂量组中剂量组大剂量组剂量（g/kg）— —0.0032 3.69 7.38 14.76神经缺损分数（分）0.000±0.000 2.330±0.580△△1.510±0.330#1.690±0.700#1.530±0.330##1.500±0.700##

2.2 各组大鼠大脑皮质区细胞的形态学观察

假手术组：细胞形态和结构均正常，胞核清晰，核仁大圆而完整，胞质色淡且均匀，胞浆丰富，血管周围未见明显炎症细胞浸润（见封三彩图图1-A）。模型组：呈明显的缺血性损害改变，正常组织结构消失，大量细胞坏死，多数细胞体积缩小，胞核固缩深染，排列紊乱，胞质明显减少，炎性细胞浸润，并可见呈空泡性坏死灶（见封三彩图图1-B）。 小剂量组： 缺血侧脑组织神经细胞损伤较模型组有所减轻，正常的神经元细胞增多，炎症细胞浸润减少，少量的空泡性坏死（见封三彩图图1-D）。 中、大剂量组与依达拉奉组：缺血侧脑组织神经细胞损伤较模型组明显减轻，正常的神经元细胞明显增多，少量炎症细胞浸润，未见明显空泡性坏死（见封三彩图图1-C、E、F）。

2.3 各组大鼠大脑皮质NF-κB/p65 和IκBα 蛋白相对表达量的比较

与假手术组比较，模型组胞核内NF-κB/p65 蛋白显著增多（P＜0.01）， 胞浆内IκBα 蛋白显著减少（P＜0.01）；与模型组比较，依达拉奉组和健脾补土方大、中、小剂量组胞核内NF-κB/p65 表达减少（P＜0.05 或P＜0.01）， 胞浆内IκBα 蛋白表达增多 （P＜0.05 或P＜0.01），依达拉奉组、健脾补土方小、中、大剂量组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表2，图2。

表2 各组大鼠大脑皮质NF-κB/p65、IκBα 蛋白相对表达量的比较 （±s，n=10）

表2 各组大鼠大脑皮质NF-κB/p65、IκBα 蛋白相对表达量的比较 （±s，n=10）

组 别假手术组模型组依达拉奉组小剂量组中剂量组大剂量组NF-κB/p65/β-actin 0.297±0.045 0.428±0.055△△0.365±0.032#0.371±0.017#0.365±0.003##0.365±0.002##IκBα/β-actin 0.450±0.060 0.230±0.030△△0.360±0.050#0.350±0.050#0.370±0.040##0.300±0.007##

图2 各组大鼠大脑皮质NF-κB/p65、IκBα 蛋白表达电泳图

3 讨论

缺血性脑卒中是指各种原因导致的脑部血流供应障碍，脑组织缺血、缺氧性坏死，出现相应神经功能缺损的疾病，是脑血管疾病（CVD）最常见的类型，严重影响人类生存质量，是威胁人类健康最严重的疾病之一。

有研究表明，NF-κB 是应激与炎性反应的中枢调节物[6]，被认为是脑缺血后炎症级联反应中最重要的调控因子之一。当细胞处于静息状态下，NF-κB与其抑制性蛋白IκB 结合，以无活性的二聚体滞留于细胞内。脑缺血/再灌注后，释放大量活性氧、氧自由基、兴奋性氨基酸及内毒素，细胞受到这些信号刺激后，IκB 激酶IKKs 磷酸化， 导致IκB 泛素化及降解，NF-κB 与IκB 解离、暴露出Rel 蛋白上的结合位点，NF-κB 被激活，与DNA 特定序列结合，诱导相关基因转录和表达，从而激活炎症因子及细胞因子，导致缺血后炎症反应的发生[7]。 目前，已有大量实验研究表明[8-9]，通过提高IκBα 的表达，抑制NF-κB 的表达，从而发挥保护大脑神经元，改善缺血/再灌脑组织损伤的作用。

健脾补土方以人参为君，以白术、茯苓、黄芪为臣，佐以山药、薏苡仁，使以炙甘草，全方具有健脾益气的功效。 实验研究发现黄芪甲苷、 人参皂苷Rg1、Rb1 能抗小鼠脑缺血再灌注后氧化应激损伤和改善能量代谢[10]，这些可能是健脾补土方抗脑缺血/再灌注损伤作用的基础之一。

Wester blot 结果显示， 健脾补土方促进脑缺血/再灌注损伤后胞浆内IκBα 蛋白表达，而抑制胞核内NF-κB/p65 的表达， 提示健脾补土方可抑制脑缺血/再灌注损伤大鼠大脑皮质胞核NF-κB/p65 蛋白的核转位和胞浆IκBα 蛋白的降解， 导致NF-κB 信号通路的激活被抑制， 进而抑制各种炎性细胞因子的表达而产生抗炎作用。

以上实验结果综合表明健脾补土方对脑缺血再灌注损伤有保护作用，其具体机制可能是通过抑制NF-κB/p65 蛋白的核转位和胞浆IκBα 蛋白的降解，从而抑制NF-κB 炎性信号通路的激活而抗脑缺血/再灌注损伤。 此外，有实验研究表明NF-κB 信号通路还直接参与促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6），炎症介质如P 选择素等黏附分子表达与调控。 如α-硫辛酸能够降低TNF-α 的表达来抑制NF-κB 的活性，达到保护局灶性脑缺血再灌注后的炎性反应损伤[11]。 滇橄榄提取物可降低IL-1β、IL-6和NF-κB 的表达来抗氧化和抑制炎症反应，保护大鼠脑缺血再灌注损伤[12]，也验证了本实验的结论。

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