哮喘血清诱导气道上皮细胞中MAL的表达及柴朴汤干预的影响

刘 鑫，夏 之，罗晓青，熊 花

（1.南华大学附属第一医院中医科，湖南 衡阳421001；2.南华大学第一临床学院，湖南 衡阳421001；3.益阳市中心医院呼吸内科，湖南 益阳413000）

支气管哮喘是一种临床上较为常见的疾病，其发病机制尚不完全清楚。 目前研究表明，支气管哮喘的病变主要是以气道慢性炎症、 气道高反应性及气道重塑为主，其中，气道重塑与哮喘症状的严重性、临床疗效及预后有密切关系[1]。 气道上皮细胞的增殖以及纤维化是气道重塑的重要组成部分， 而T 细胞成熟相关蛋白 （T-lymphocyte maturation associated protein T，MAL）有着维持上皮细胞稳定性的作用，研究表明，MAL 随着大鼠哮喘病程的进展，表达动态下调[2]。 明代王肯堂《证治准绳》的柴朴汤，由小柴胡汤和半夏厚朴汤组成，有行气、化痰、平喘的作用。 本研究旨在探讨柴朴汤对哮喘气道上皮细胞中MAL 表达的影响，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性SD 大鼠64 只（南华大学动物部提供），体质量(250±10) g。 动物许可证号：scxk （湘）2009-0012， 饲养室温维持在18～22 ℃之间， 相对湿度40%～70%， 饲养环境合格证号：scxk（湘）2009-0010，按标准化饲养，喂全价营养饲料，每日2～3 次按时喂养，每天更换饮用水源。

1.1.2 主要试剂 卵蛋白(OVA，美国Sigma 公司，批号：120602)；氢氧化铝粉末（天津生化试剂厂，批号：120802）；小鼠MAL 抗体（博士德生物技术有限公司，批号：20120818）；SABC 免疫组化试剂盒 （博奥森生物技术有限公司， 批号：20120713）；DAB 显色试剂盒 （博奥森生物技术有限公司， 批号：20120728）；MAL PCR 引物[生工生物工程（上海）股份有限公司，批号：E·129911，上游引物：5-CAG AGC AAT TAA CTG GTC AGC CT-3， 下游引物：5-GGA AGT TAA ATT CAG CAA GCC CT-3]；RNA 提取试剂盒 （东盛生物技术有限公司， 批号：00073758）；RNA 样本保存液 （天根生物， 批号：00084763）。

1.1.3 试药 中药柴朴汤：由柴胡、半夏、茯苓、黄芩、厚朴、大枣、白参、甘草、苏叶、生姜中药配方颗粒组成，按7∶5∶3∶3∶3∶3∶2∶2∶2∶1 比例配制，由一方制药有限公司提供，批号：406170t。 1 g 颗粒剂相当于生药6.8 g，用蒸馏水冲泡，现配现用。

1.1.4 主要仪器 多功能超声雾化器（鞍山电子医疗仪器厂，YZB/辽0390-2006 JSC 型）；PCR 仪（美国biometra，HBPX2）； 轮转式切片机 （德国来卡公司，RM2245）；凝胶成像分析系统（英国UVP 公司，BioSpectrum 410）； 紫外分光光度仪 （日本岛津公司，UV-1206 型分光光度仪）；电泳仪（北京市六一仪器厂，DYY-7C 型）；光学显微镜（o1ympus 公司，SZ61）。

1.1.5 实验细胞 由中国医学科学院基础医学研究所提供大鼠气道上皮细胞， 资源编号：3111C0001CCC000149。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及含药血清制备 随机从64 只健康雄性SD 大鼠中抽取32 只分为4 组， 即正常组8只，柴朴汤高剂量组8 只（高剂量组）、中剂量组8只（中剂量组）、低剂量组8 只（低剂量组），生理盐水组8 只（正常组）。 剩余为模型组32 只。 柴朴汤高、中、低剂量组按体表面积[3]折算后，每日给药提取物量分别为3.00、1.50、0.75 g/kg、 正常组给予等体积生理盐水，每日2 次，连续灌胃给药7 d。末次给药1 h 后，乙醚麻醉，无菌条件下，经心脏采血，每只大白鼠约采集5 mL 血液，冷置1 h，4 ℃，2 500 r/min 离心25 min， 分离得0.5 mL 血清，于56 ℃温育30 min 灭活，每组8 份血清混合，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌后分装，-20 ℃冰箱保存备用。 所取血清分别为柴朴汤高、中、低剂量组、正常组。

1.2.2 哮喘血清大鼠模型建立[4]及大鼠哮喘血清的采集 模型组在第1 天和第8 天腹腔注射卵蛋白[Albumin（egg white），OVA]1 mg+氢氧化铝200 mg+生理盐水1 mL 混悬液分别在大鼠两腹股沟、腹部、前足趾4个部位皮下注射，每处0.2 mL，同时腹腔注射0.2 mL 致敏，第15 天时以1%OVA 雾化激发，每次激发时间30 min，隔天1 次，共8 周。抗原激发后，以大鼠出现呼吸加深加快、呼吸困难、腹肌收缩、行动缓慢呆滞、精神萎靡等为激发成功标志，代表哮喘模型复制成功。 末次激发后，用乙醚麻醉大鼠无菌条件下心脏采血， 每只大白鼠约采集5 mL血液，冷置1 h，离心(4 ℃，2 500 r/min，25 min)，分离约0.5 mL 血清，于56 ℃温育30 min 灭活，共32份血清混合，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，-70 ℃冰箱保存备用。 所取血清为大鼠哮喘血清。

1.2.3 大鼠气道上皮细胞的培养 将大鼠气道上皮细胞以DMEM 完全培养基制成细胞悬液，置37 ℃、体积分数5% CO2中培养，隔天换液，倒置显微镜下观察细胞生长情况，待细胞长至生长基质的70%～80%表面积，予以传代培养。

1.2.4 分组及细胞诱导 取传代的第20 代生长良好的大鼠气道上皮细胞分为：正常血清组、柴朴汤高剂量血清+哮喘血清（下称柴哮高组）、柴朴汤中剂量血清+哮喘血清（下称柴哮中组）、柴朴汤低剂量血清+哮喘血清（下称柴哮低组）、正常血清+哮喘血清（下称盐哮血清）、哮喘血清。 每组样本数为5，各血清总浓度均为20%，其中柴哮高、中、低组、盐哮血清各血清浓度为10%，混合后为20%[4]，各组培养基量相等。 培养24 h，弃细胞培养液，收集细胞。

1.3 指标检测

1.3.1 肺组织标本留取及组织形态学观察 取血后留取模型组及正常组大鼠，充分暴露胸腔，左肺上叶注入4%的多聚甲醛5 mL， 取下后置于4%的多聚甲醛溶液中保存固定1 周， 取固定的肺组织，常规石蜡包埋、切片，HE 染色，光学显微镜下观察切片肺脏组织形态结构。

1.3.2 各组气道上皮细胞中MAL mRNA 检测 用半定量RT-PCR 检测气道上皮细胞中MAL 信使核糖核酸（Messenger RNA，mRNA）的表达，按东盛生物技术有限公司提供试剂盒操作方法进行。 取实验上皮细胞，经研磨、裂解、沉淀、洗涤、离心等处理后， 溶解于DEPC 处理水中。 用紫外分光光度计测A260/A280 的比值（OD 值）在1.8～2.0 之间，1.5%琼脂糖凝胶电泳观察28S 与18S 条带清晰且密度比值约等于2，表明RNA 样品无污染，可用。根据基因库基因序列设计引物序列，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，扩增引物如下：上游引物：5-CAG AGC AAT TAA CTG GTC AGC CT-3，下游引物：5-GGA AGT TAA ATT CAG CAA GCC CT-3，产物扩增长度：185 bp。 预变性94 ℃5 min，变性94 ℃60 s，退火54 ℃50 s，延伸72 ℃50 s，共30个循环， 终末延伸72 ℃7 min， 肌动蛋白[（β-non-muscle actin，β-actin) 上游引物：5-TCA GGT CAT CAC TAT CGG CAA T-3，下游引物：5-AAA GAA AGG GTG TAA AAC GCA-3， 产物扩增长度：432 bp]也按以上程序一起扩增。 循环后PCR 扩增产物加入1.5%琼脂糖电泳分离，Image-Tool 2.0 分析各组电泳条带灰度积分，以β-actin 的灰度积分作为标准校正各组MAL 电泳条带灰度积分，得出MAL 的相对灰度值，进行半定量分析。

1.3.3 各组气道上皮细胞中MAL 蛋白的检测 用免疫组化检测气道上皮细胞中MAL 蛋白的表达，按博奥森生物技术有限公司提供试剂盒操作方法进行。 常规10%甲醛固定30 min，脱蜡、水化。 用磷酸盐生理盐水缓冲液（PBS）（0.01 M）冲洗3 次，每次3 min； 细胞抗原加热修复： 煮沸2 次后PBS 洗5 min； 过氧化酶阻断剂封闭 15 min，PBS 冲洗，3 min×3 次；滴加5%BSA 封闭液，室温20 min；滴加稀释为1∶330 的MAL 抗， 室温下过夜，PBS 冲洗3 min×3 次； 滴加二抗孵育10 min 后，PBS 冲洗3 min×3 次；水冲洗，苏木素复染；DAB 显色：室温显色3～10 min；脱水干燥、二甲苯透明、中性树胶封片、光学显微镜观察。 阳性信号为胞质或胞核呈现棕黄色颗粒。 采集图像后，以Image-pro plus 5.1 图像分析软件系统， 测定阳性颗粒的平均光密度（average optical density，AOD）， 计算其平均值， 代表MAL 蛋白表达的相对含量。

1.4 统计学分析

所有数据应用SPSS 18.0 统计软件分析，计量资料以“±s”表示，方差齐者用方差分析，方差不齐用秩和检验，组间差异显著性检验用F 检验，两两比较用q 检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠的组织病理学观察

正常组：大鼠肺组织结构正常，气道上皮细胞结构完整无明显的炎症细胞浸润，肺泡结构形态未见破坏（第72 页彩图图1①）。 哮喘组：大鼠肺组织可以见到大量炎症细胞浸润，黏膜皱襞较多，气道上皮细胞变性、坏死，可见到管腔狭窄，黏液分泌增多致气道狭窄、闭塞。肺间质可见新生血管形成。大量胶原纤维形成，基底膜加宽加厚，大部分肺泡破坏、融合，肺泡腔扩大，肺泡间隔断裂（第72 页彩图图1②）。

MAL 电泳图示：MAL 电泳条带在185 bp 处可见，正常血清组mRNA 的条带最亮，柴哮高组、柴哮中组、柴哮低组次之，盐哮血清、哮喘血清组最暗。结果见图2。

图2 MAL 基因表达电泳图

2.2 各组MALmRNA 和蛋白表达的比较

MALmRNA 和MAL 的AOD 值在正常血清组最高，与其它各组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；柴哮高、中、低组较盐哮血清组、 哮喘血清组升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。 结果见表1。

表1 各组MAL mRNA 和蛋白表达的比较（±s，n=5）

表1 各组MAL mRNA 和蛋白表达的比较（±s，n=5）

注：与正常血清比较●P＜0.05；与盐哮血清、哮喘血清比较★P＜0.05。

组 别 MAL mRNA 相对灰度值 OD 值正常血清 0.82±0.04 0.88±0.03盐哮血清 0.28±0.02● 0.36±0.04●哮喘血清 0.26±0.02● 0.32±0.03●柴哮高组 0.54±0.02●★ 0.57±0.07●★柴哮中组 0.57±0.02●★ 0.62±0.06●★柴哮低组 0.41±0.01●★ 0.49±0.11●★

2.3 各组大鼠气道上皮细胞中MAL 蛋白的表达

免疫组化结果显示：正常血清组、柴哮高组、柴哮中组、柴哮低组、盐哮血清组、 哮喘血清组均可见MAL 蛋白免疫反应阳性的棕黄色颗粒细胞。 正常血清组表达最强，柴哮高组、柴哮中组、柴哮低组较正常血清组表达减少，在盐哮血清组、哮喘血清组表达最弱。 见第72 页彩图图3。

3 讨论

在哮喘发病中，气道上皮细胞可以释放多种细胞因子和炎症介质，造成级联放大效应及上皮细胞的损伤， 导致气道纤毛的清除功能及屏障功能受损， 长期的慢性炎症刺激可引起以杯状细胞增生、上皮细胞纤维化及平滑肌细胞增生肥大为主要病理变化的气道重塑[5]。Holgate 等[6]认为在有害物质刺激下气道上皮细胞正常修复机制受损，是导致难治性哮喘的重要原因。 可见上皮细胞作为气道内外环境的第一道物理屏障，其结构的破坏及持续的炎症反应，在气道过敏反应性炎症及气道重塑的发生与发展中，都有着不可忽略的作用。

MAL 基因最初发现于1987年，Alons[7]发现该基因表达于T 淋巴细胞分化中晚期，编码产物为一种高度疏水性蛋白，研究发现，MAL 隶属于MAL 基因家族，该家族成员编码产物均属于四折跨膜蛋白质，具有相似的生化特性，并在呼吸系统、胃肠道、泌尿生殖系统、内分泌腺体等多种组织的上皮细胞中均有广泛表达。

MAL 在气道上皮细胞内表达较显著，它定位于上皮细胞的顶膜区，是顶端运输机制中的膜内在蛋白，参与脂质囊泡介导的顶端传送体的形成，将上皮细胞中的蛋白输送到顶端膜中。 Martín-Belmonte等[8]研究表明，MAL 重要的功能为基底和顶端转运，可在质膜、内质网、高尔基体之间循环运送蛋白，对维持上皮细胞内环境的稳定性具有重大意义。

MAL 也是上皮细胞的顶端靶向过程中的重要组成部分，与细胞膜上酪氨酸激酶高效率表达有密切联系， 研究表明，MAL 参与控制上皮细胞吸收和分泌功能，并可调控顶端膜蛋白的转运与蛋白的分泌机制[9]。 其功能涉及上皮细胞中胞内运输，信号传导等相关方面，与维持上皮细胞正常的形态和功能密切相关。 在去除MAL 的情况下，酪氨酸激酶在质膜的功能将遭受破坏。 而酪氨酸激酶与多种细胞信号传导机制有关，在气道炎症反应和气道重塑中都有十分重要的作用[10]。 MAL 缺失可以引起上皮细胞形态及功能的改变甚至恶性增殖过程。

中医学认为[11]“外因诱发，触动伏痰，痰阻气道，气道壅塞”为哮喘的发病机制。 柴朴汤由小柴胡汤和半夏厚朴汤组成，全方有行气、化痰、平喘的作用。 是中医治疗哮喘的方剂之一。

本课题组前期研究发现，柴朴汤可以减轻炎症细胞的浸润，抑制气道的重塑[12]。 通过基因芯片技术，对差异表达基因进行Pathway 及GO 分析，我们发现MAL 基因在哮喘大鼠模型中表达下调， 而柴朴汤可以逆转这一现象，且柴朴汤组中气道炎症程度及气道重塑情况都较哮喘模型组减轻，说明柴朴汤治疗哮喘的作用靶点可能与MAL 有关[2]。而MAL基因在气道上皮细胞中表达较为显著，与上皮细胞内运输、信号传导等功能关系密切，因此我们推测MAL 通过维持气道上皮细胞的正常形态和功能，进而抑制哮喘发生过程中上皮细胞产生细胞因子及炎症介质过程， 从而减弱上皮细胞的炎症反应，以及炎症所致的气道上皮细胞纤维化、气道重塑的相关病理变化和发展。MAL 表达下降则导致气道上皮细胞正常极性发生改变，从而使气道内外环境的第一道物理屏障即气道上皮发生了一系列的生理改变，导致哮喘发生、发展。

本实验结果表明：哮喘血清可诱导气道上皮细胞中MAL 的表达下调， 加重气道上皮的炎症反应及重塑情况，而柴朴汤上调MAL 的表达，从而维护气道上皮的正常结构和功能。 但柴朴汤上调MAL表达的具体机制，仍有待进一步实验。

[1]Payne DN，Rogers AV，Adlehoth E，et al. Earlythickening of the reticular basement membrane in children with difficult asthma1[J]. Am J Re spir Crit Care Med，2003，167(1)：78-82.

[2]刘 鑫，熊 花.基因芯片技术筛选哮喘大鼠差异表达基因的研究[J].中国现代医学杂志，2013，23（10）：10-15.

[3]张维溪，李昌崇，程晓明，等.哮喘小鼠支气管MIP－1α、RANTES基因和蛋白的表达[J].中国病理生理杂志，2004，20(5)：858－861.

[4]Iwama H，Amagaya S，Ogihara Y. Eff ect of sho saiko to a japanese and chinese traditiona l herbal medicinl mix ture，on the mitogenic activity of lipopoly saccha ride：a new pharmacological testing method. Journal of Ethnopharmacology，1987，21：45-53.

[5]Nakagome K，Nagata M. Pathogenesis of airway inflammation in bronchial asthma [J]. Auris Nasus Larynx，2011，38（5）：555－563.

[6]Holgate ST，Davies DE. Rethinkingthe pathogenesis of asthma[J]. Immunity，2009，31（3）：362－367.

[7]Alonso MA，Weissman SM. cDNA cloning and sequence of MAL，ahydrophobic protein associated with human T-cell differentiation[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1987，84(7)：1 997-2 001.

[8]Martín-Belmonte F，Puertollano R，Millán J， et al. The MAL proteolipid is necessary for the overall apical delivery of membrane proteins in the polarized epithelial Madin-Darby canine kidney and fischer rat thyroid cell lines [J]. Mol Biol Cell，2000，11(6)：2 033-2 045.

[9]Kamsteeg EJ，Duffield AS，Konings IB， et al. MALdecreases the internalization of the aquaporin-2 water channel [J]. PNAS，2007，104(42)：16 696-16 701.

[10]Wong WSF，Koh DSK. Advances in immunopharmacology of asthma [J]. Biochem pharmacol，2000(59)：1 323-1 335.

[11]欧正武，帅明华.哮喘伏痰新识[J].湖南中医学院学报，1998，18(4)：25.

[12]黄 艳，刘 鑫，戴爱国，等.柴朴汤对卵蛋白诱导豚鼠哮喘的干预作用与对核因子-κB 的影响[J].中医药导报，2007，13(6)：1-3.