Nucleolin与VEGF在结肠癌中的表达及其与转移的关系

林 冰，雷 晴，郎锦义，王春婷

(1．成都中医药大学附属医院，成都610000;2．四川省肿瘤医院，成都610041;3．四川大学，成都610000)

结肠癌是危害人类健康的常见消化道恶性肿瘤，全球结直肠癌发病率平均每年以2%速率递增，老年人多见，但青少年也有逐年增多的趋势［1］。在我国，随着人民生活水平的不断提高，结肠癌的发病率也在逐年增加，呈明显上升趋势，目前结肠癌已成为我国重点防治的肿瘤之一。结肠癌的发生、发展、浸润及转移机制非常复杂，包括癌基因的突变和过度表达，抑癌基因的缺失或突变等因素在结肠癌的演变过程中都起到了重要作用［2］。

血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种特异作用于内皮细胞的多功能因子，在正常组织中表达水平较低，但是在许多肿瘤组织中表达水平较高，在肿瘤血管生成过程中起重要作用［3］。

Nucleolin广泛存在于真核细胞的细胞核中，作为一个多功能核蛋白，参与调节细胞增殖，胞质分裂，细胞复制，胚胎发生等生命过程［4］。同时，Nucleolin在部分肿瘤细胞及内皮细胞表面也呈高表达，近期的研究表明细胞膜表面的nucleolin参与肿瘤的发生发展过程［5］。此外，nucleolin与肿瘤发生及血管生成相关的一系列的配体结合，如hepatocyte growth factor、endostatin、tumor-homing peptide F3 、laminin、P-selectin、midkine等，通过功能性阻断以及下调细胞膜表面的nucleolin，抑制内皮细胞的迁移及血管生成，并引起内皮细胞的凋亡［6］。有研究表明，nucleolin的核定位水平越高，膜定位水平越低，胰腺癌病人的预后越好，表明细胞膜表面的nucleolin可能作为一个潜在的肿瘤治疗靶点［7］。

本文运用组织芯片技术，检测Nucleolin蛋白在正常组织、结肠癌组织和淋巴结、肝脏转移性结肠癌组织中的表达情况，探讨其与结肠癌病理分级、临床分期之间的关系，及相关信号通路。

1 材料和方法

1．1 研究对象

组织芯片 结肠癌组织芯片(BC05115)购自陕西艾丽娜生物科技公司，含有结肠癌，结肠癌肝转移，结肠癌淋巴结转移及各类组织微阵列，其中结肠癌30例，结肠癌肝转移5例，结肠癌淋巴结转移25例，正常结肠、肝及淋巴结各3例，一例一点。阵列点直径1．5mm，厚度5μm。详细材料见表1．

1．2 免疫组织化学染色

一抗兔抗人nucleolin和兔抗人VEGF多克隆抗体，购自ProteinTech Group公司，采用1:250的比例稀释。SP免疫组织化学法，以PBS液替代一抗做阴性对照，以试剂公司提供的阳性样品做阳性对照。免疫组化结果采用OLYMPUS公司全自动显微镜照相装置采集。光镜下nucleolin和VEGF阳性表达主要呈棕色或棕黄色颗粒。评分标准采用半定量评分［8］:①按染色强度评分，基本不着色者为0分，着色淡者为1分，着色适中者为2分。②按照视野内阳性细胞数，阳性率=阳性细胞/总细胞数×100%。＜5%为0分，5～25%为1分，26～50%为2分，＞50%为3分。以两种评分的乘积作为免疫组化半定量得分，≤1分判定为阴性，≥2分判定为阳性。

1．3 统计学分析

采用SPSS17．0软件进行统计学处理，采用X2检验对定性资料进行统计分析，以P=0．05为检验标准，P＜0．05，差异具有统计学意义。

2 结果

2．1 Nucleolin和VEGF在正常结肠组织、结肠癌组织和转移性结肠癌组织中的表达

光镜下，VEGF阳性表达于细胞浆，在正常结肠组织、结肠癌组织和转移性结肠癌组织中的平均评分为3．85 ±0．47、4．93 ±0．40 和6．80 ±0．70，差异具有统计学意义(P＜0．05)。VEGF在转移结肠癌中的表达显著高于结肠癌(P＜0．05)。Nucleolin表达于细胞核、细胞浆和细胞膜，在正常结肠组织、结肠癌组织和转移性结肠癌组织中的总评分分别为2．65±0．47、3．43 ±0．55、4．03 ±0．65，Nucleolin 总的表达水平在正常结肠组织和结肠癌组织中差异具有统计学意义(P＜0．05)，但是在结肠癌和转移性结肠癌组织中的差异不具有统计学意义(P＞0．05)(见图1)。

2．2 Nucleolin和VEGF的表达与结肠癌临床病理特征的关系

VEGF在转移性结肠癌中的表达显著高于结肠癌(P＜0．05)，与患者年龄、性别无相关性(P＞0．05)，与组织的分化程度、TNM病理分期无相关性(P＞0．05)。总的Nucleolin的表达水平在转移性结肠癌与原位结肠癌中无显著性差别(P＞0．05)，与患者年龄、性别无相关性(P＞0．05)，与组织的分化程度、TNM病理分期无相关性(P＞0．05)(见表1)。

图1 Nucleolin和VEGF在正常组织和结肠癌组织中的表达情况

表1 Nucleolin和VEGF的表达与结肠癌临床病理特征的关系

2．3 Nucleolin在转移性结肠腺癌中亚细胞表达部位的改变及其与VEGF的关系

Nucleolin蛋白表达水平在结肠癌和淋巴结转移及肝转移的结肠癌组织中差异无统计学意义(P＞0．05)，但是，与原发结肠癌相比，在转移性结肠癌中，Nucleolin核着色减弱，胞浆和胞膜着色增强。VEGF在淋巴结转移和肝转移的结肠癌组织中的表达水平显著高于原位结肠癌组织(4．93 ±0．40，6．80 ±0．70，P=0．02)，且肝转移灶中表达水平更高(见图2)。这一结果提示，Nucleolin蛋白在转移性结肠腺癌中的亚细胞表达部位的改变可能和VEGF相关。

2 讨论

结肠癌是临床常见的恶性肿瘤，随着生活水平的提高，结肠癌在我国的发病率呈现逐年上升的趋势，已严重威胁人类健康。目前手术是结肠癌最有效的治疗方法，结肠癌术后的复发和转移所导致的相关并发症是结肠癌患者的主要死因［2］。肿瘤侵袭转移过程是多阶段的、复杂的、具有高度选择性的过程。它涉及肿瘤细胞本身与宿主之间错综复杂的关系，肿瘤血管生成和宿主免疫系统的各种反应，并受多种相关基因的调控，其确切机制尚未明了，是目前肿瘤研究的热点和难点之一［9］。

VEGF在肿瘤形成和生长及在转移瘤的形成中起着十分重要的作用，在许多人类肿瘤中，VEGF的表达水平与患者的生存期密切相关。VEGF的表达受到许多信号通路的调节，包括低氧、激素以及细胞因子的刺激。同时，也会取决于细胞的环境，如活化的癌基因的刺激［10］。

Nucleolin是真核细胞核仁中最主要的一种蛋白质，可以调控核糖体的生物合成与成熟，细胞增殖生长、胚胎发生、胞质分裂、染色体复制与核仁发生等过程［4］。肿瘤细胞表面的Nucleolin可作为细胞的受体，与多种配体相结合，参与肿瘤细胞的信号传导［5-6］。已有文章报道，Nucleolin是血管内皮抑素的新型功能性受体，血管内皮抑素与新生血管的内皮细胞膜上的Nucleolin高亲和性结合后内化，转运入核，抑制Nucleolin的磷酸化，从而抑制血管内皮细胞增殖的过程，抑制肿瘤新生血管生成［8］。同时，肿瘤细胞膜表面的Nucleolin也与胃癌和胰腺癌患者的预后相关［11］。

图2 Nucleolin和VEGF在转移性结肠腺癌中发生表达改变

在本文中，我们采用结肠癌组织芯片，通过免疫组化方法检测了Nucleolin和VEGF在结肠癌、转移性结肠癌和癌旁正常组织中的表达。结果显示，VEGF阳性表达于细胞浆，在结肠癌组织和转移性结肠癌组织中的表达显著高于癌旁正常结肠组织(P＜0．05)，转移性结肠癌组织中的表达显著高于无转移的结肠癌组织(P＜0．05)。Nucleolin主要表达于细胞核，也在细胞浆和细胞膜有部分表达，Nucleolin总的表达水平在正常结肠组织和结肠癌组织中差异具有统计学意义(P＜0．05)，但是在结肠癌和转移性结肠癌组织中的差异不具有统计学意义(P＞0．05)。VEGF和总的Nucleolin的表达水平与患者年龄、性别无相关性(P＞0．05)，与组织的分化程度、TNM病理分期无相关性(P＞0．05)。但是，在转移性结肠癌中，Nucleolin核着色减弱，胞浆和胞膜着色增强。VEGF在淋巴结转移和肝转移的结肠癌组织中的表达水平显著高于原位结肠癌组织(P=0．02)，且肝转移灶中表达水平更高，两者变化趋势一致，这一结果提示，Nucleolin蛋白从细胞核到细胞浆和细胞膜的转位可能和结肠癌的侵袭转移相关，VEGF相关信号通路可能参与了这一过程。

综上，Nucleolin蛋白胞核向胞膜的转位与结肠癌的转移相关，VEGF可能参与了这一过程，Nucleolin有望成为结肠癌侵袭转移治疗的有效靶点。

［1］ Brenner H，Kloor M，Pox CP．Colorectal cancer［J］．Lancet，2014，26;383(9927):1490-502．

［2］ Ferlay J，Soerjomataram I，Ervik M，et al．Globocan 2012:Estimated cancer incidence，mortality and prevalence worldwide in 2012［EB/OL］．http://globocan．iarc．fr，2013．12．5．

［3］ Cimpean AM，Mazuru V，Saptefrati L，et al．Prox 1，VEGF-C and VEGFR3 expression during cervical neoplasia progression as evidence of an early lymphangiogenicswitch［J］．Histol Histopathol，2012，27(12):1543-1550．

［4］ 王慷慨，肖献忠．核仁素在细胞增殖与细胞凋亡中的作用［J］．中南大学学报(医学版)，2004，29(6):707-710．

［5］ 蒙国照，肖胜军，曾思恩，等．细胞表面核仁素表达下调抑制肝癌细胞生长［J］．中华肿瘤杂志，2011，33(1):23-27．

［6］ Christian S，Pilch J，Akerman ME，et al．Nucleolin expressed at the cell surface is a marker of endothelial cells in angiogenic blood vessels［J］．JCell Biol，2003，163(4):871 – 878．

［7］ Wise JF，Berkova Z，Mathur R，et al．Nucleolin inhibits Fas ligand binding and suppresses Fas-mediated apoptosisin vivo via a surface nucleolin-Fas complex［J］．Blood，2013，121(23):4729–4739．

［8］ Song N，Ding Y，Zhuo W，et al．The nuclear translocation of endostatin is mediated by its receptor nucleolin in endothelial cells［J］．Angiogenesis，2012，15(4):697 – 711．

［9］ Moustakas A，Heldin CH．Signaling networks guiding epithelialmesenchymal transitions during embryogenesis and cancer progression［J］．Cancer Sci，2007，98(10):1512-1520．

［10］ Chekhonin VP，Shein SA，Korchagina AA，et al．VEGF in tumor progression and targeted therapy［J］．Curr Cancer Drug Targets ，2013，13(4):423 – 443．

［11］韩亚楠，周 林，刘常浩，等．核仁素在胃癌组织芯片中的表达及其意义［J］．现代肿瘤医学，2013，21(6):1280-1283．