利用siRNA高通量测序技术检测烟草病毒

王浩军，王芳，姚忠达，郭东锋，舒俊生

1 安徽中烟工业有限责任公司技术中心，合肥市天达路9号，230088;

2 安徽省农业科学院烟草研究所，合肥市农科南路40号，230031

利用siRNA高通量测序技术检测烟草病毒

王浩军1，王芳2，姚忠达1，郭东锋1，舒俊生1

1 安徽中烟工业有限责任公司技术中心，合肥市天达路9号，230088;

2 安徽省农业科学院烟草研究所，合肥市农科南路40号，230031

植物可以利用小干扰RNA(siRNA)机制干扰体内RNA病毒的增殖，从而获得对该病毒的免疫能力。为了快速检测田间烟草病毒病种类和发现烟草新病毒，本文通过第二代测序技术对烟草的小RNA进行高通量测序，利用软件velvet version 1.1.06对测得的短序列进行组装，再通过生物信息学方法将得到的重叠群进行数据库比对寻找其中的病毒序列。研究结果得出我国安徽皖南烟区烟草存在PVY、CMV、TMV和TVBMV等RNA病毒。检测到3个重叠群与Potato leafroll virus部分同源，同源性低于90%，疑似一种烟草新病毒。至此建立了检测烟草病毒和发现新病毒的一种新方法，可用于大田烟草病毒的本底调查。

高通量测序;小干扰RNA;病毒检测

烟草是我国的主要经济作物之一，病毒病是烟草生产上的重要病害。常见的烟草病毒主要有马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、烟草脉带花叶病毒（Tobacco vein banding mosaic virus，TVMBV）和番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）[1]等。此外，近年来在烟草上还检测到一些不常见的病毒如 南美红辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV）[2]、番茄环纹斑点病毒（Tomato zonate spot virus,ZTSV）[3]和番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）[4]。这些病毒都对烟草造成严重的危害。调查烟田已知和未知的病毒，对了解不同烟区病毒病情况，防治和控制病毒病具有一定意义。

植物具有siRNA的天然抗病毒机制，当外来的RNA病毒在植物体内复制时，机体会启动该机制，产生大量针对入侵病毒的siRNA。siRNA是长为20-25个核苷酸的小分子RNA，在植物体内通过与靶RNA结合导致靶RNA的降解。植物就是利用这种机制抵抗病毒侵染[5]。由于siRNA具有分子量小的特点，可以很容易地与细胞中的mRNA，tRNA，rRNA区别出来，因此通过分析siRNA寻找动植物中的病毒成为一种简便易行的手段，Wu等人利用这种方法发现多种果蝇携带的新病毒[6]。Ma等利用小RNA高通量测序技术检测了蚊子的DNA病毒[7]。本文利用siRNA高通量测序及组装技术对采自安徽皖南烟区的烟草病毒样本进行检测，以期探明安徽皖南烟区烟草病毒病种类。

1 材料与方 法

1.1 试验材料

发病烟草材料采自安徽皖南烟区。采集烟草样品主要症状为:叶片表现叶脉坏死，花叶，褶皱鼠尾状，黄斑，坏死斑点，叶片皱缩。大田期样品采集时间为2013年6月。采集部位烟叶上部叶，样品用锡箔纸包裹液氮保存。所采集的样品混合构成一个小RNA文库。

1.2 血清学检测

采用购自ADGEN的DAS-ELISA检测试剂盒对病样进行检测,具体检测方法参照说明书。抗血清选用番茄斑萎病毒(TSWV)、马铃薯Y病毒(PVY)、烟草饰文病毒(TEV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草花叶病毒(TMV)、烟草脉带花叶病毒(TVBMV)和烟草环斑病毒(TR SV)。样品采用同一烟区的混合样品进行检测。

1.3 烟草总 RNA的提取

采用RNAiso Plus，从烟草叶片中提取植物总RNA。液氮研磨1g混合叶片样品至粉末状，无明显的可见颗粒，向研钵中加入3mL RNAiso Plus，将研磨成粉末状的样品完全覆盖，室温静置20-30min，直至样品完全融化，继续研磨至裂解液呈透明状，分装到三个2mL的离心管中，室温静置5min，12000g，4℃离心5min，吸取上清于新的离心管中，加入200μL氯仿，剧烈震荡15s，待溶液充分乳化无分相现象后，室温静置5min，12000g，4℃离心15min，吸取上清液于新的离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒充分混匀，室温静置10min，12000g，4℃离心10min取沉淀，离心管中加入1mL75%的乙醇，上下颠倒离心管，12000g，4℃离心5min后，弃去乙醇，室温干燥沉淀2-5min，加入适量RNase-free水溶解沉淀，于-80℃保存。

1.4 建库及测序

纯化的RNA用BioAnalyzer 2100和超微量分光光度计Nanodrop ND-2000进行纯度评估和260nm吸光度检测。测序前的RNA样品用聚乙二醇(PEG8000)沉淀，沉淀的RNA两端加上接头，利用加了接头的小RNA为模板进行cDNA合成。合成的cDNA经过15个PCR循环构建成小RNA文库。文库测序依据边合成边测序的方法，测序平台为Illumina Hiseq 2000。

1.5 样本病毒分析

去除低质量，未插入接头的读段（reads），去除带多聚A（polyA）的数据，最后选取不小于18nt的读段。处理后的序列用序列组装软件velvet version 1.1.06进行短序列组装，由于小RNA文库中序列均较短，所以设定参数hash_length 17。组装的重叠群寻找高度同源序列：首先，用Blastn将组装的重叠群与核酸数据库nt database比对，从比对结果中选出每一条序列的比对结果中e值最小的结果，再筛选出这些结果中比对序列的覆盖度（coverage）至少达到90%且同源性（identity）也至少达到90%的结果。组装的重叠群寻找部分同源序列：将寻找高度同源序列中没有找到高度同源性的重叠群用Blastx在蛋白质数据库nr database中寻找同源序列，所设参数为 -e 1e-3，从每一条重叠群的比对结果中选出e值最小的结果。筛选和已知病毒序列具有同源性的重叠群：从寻找高度同源序列和寻找部分同源序列筛选出的结果中选出和病毒序列同源的重叠群，这些重叠群必须只和病毒同源，若和非病毒序列也具有同等的同源性，则舍弃。

2 结果与分析

2.1 血清学检测结果

用1.1中的烟草样品，采用TSWV、PVY、CMV、TMV、TEV、TRSV、TVBMV 7个抗血清进行检测。样品与PVY、CMV、TMV和TVBMV呈阳性，样品与TSWV、TEV和TRSV均呈阴性。

2.2 小 RNA高通量测序分析

安徽皖南烟区烟草样本经RNA提取，小RNA分离，纯化和测序处理，处理读段为20405970个，共组装成10004条重叠群（contig）。小RNA文库序列长度分布主要集中在21 nt，22 nt和24 nt (图1)，实际情况中植物miRNA，siRNA的长度也主要集中在这三种长度，因此说明了烟草样本建库的质量高，符合实际情况。

图1 安徽烟草文库小 RNA测序reads长度分布Fig.1 Reads length distribution of small RNA from tobacco libr ary of Anhui province

2.3 烟草病毒检测结果

所得序列用序列组装软件Velvet version 1.1.06进行短序列组装，组装的重叠群寻找高度同源序列（同源性大于90%）和部分同源序列（同源性低于90%），从所得序列中筛选与病毒同源的重叠群比对结果如表1。

表1 安徽烟草文库病毒检测结果Tab.1 Virus detection results from tobacco library of Anhui

从病毒检测结果中我们可以看出，文库中检测到 了 PVY、CMV、TMV、TVBMV、TuYV、BrYV和PLRV 7种病毒。其中PVY同源重叠群数目最高为732，其次检测到了TMV、CMV和TVBMV同源重叠群数分别为74、492和122，这4种病毒检测结果同常规ELISA检测结果相符（数据未列出）。小RNA文库还检测到了芸薹黄化病毒（Brassica yellows virus，BrYV）和芜菁黄化病毒（Turnip yellows virus，TuYV），这两种病毒同属于马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus)，黄症病毒科(Luteoviridae)，测序结果需要进一步的试验验证才能明确所采集的样品里是否含有这两种病毒。在样本中还检测到了3个重叠群与Potato leafroll virus部分同源的病毒（图2），3个重叠群与已经报道的Potato leafroll virus同源性最高，但是低于90%，这可能是检测到的新病毒。

图2 新病毒与Potato leafroll virus比对结果Fig.2 Comparison between new virus and Potato leafroll virus

2.4 部分同源小 RNA的RT-PCR验证

采用RT-PCR方法对测序并且拼接的与Potato leafroll virus同源的重叠群进行验证。设计特异性引物扩增三个重叠群片段。RT-PCR的结果（图3）得到了目的条带，这充分说明了该新病毒在烟草里确实存在。

图3 样本中测序拼接的与 Potato leafroll virus部分同源重叠群的RT-PCR验证Fig.3 RT-PCR verification of sequencing contigs in samples homologous with Potato leafroll virus

3 结论与讨论

本研究利用小RNA测序及组装技术发现安徽皖南烟区存在PVY、TMV、CMV、TVBMV、BrYV、TuYV以及一种与Potato leafroll virus部分同源的新病毒。其中PVY、TMV、CMV和TVBMV与酶联免疫法（ELISA）检测结果一致，证明所采集的样品中确实含有PVY、TMV、CMV和TVBMV。BrYV、TuYV需进行进一步RT-PCR试验验证是否含有这两种病毒。发现的一种新病毒，其同源性与Potato leafroll virus最高，但低于90%。

常规的病毒检测方法主要有电镜法，酶联免疫法（ELISA），聚合酶链式反应法（PCR），这些方法在病毒检测和新病毒的发现中存在一定的缺陷，检测病毒的范围也比较固定，对于新病毒的发现较困难，如ELISA检测的阳性反应毒原种类只能与使用的抗血清种类一致，可能出现假阳性反应，从而对结果的准确性有一定的影响；RT-PCR法检测病毒需要根据已知序列设计引物，使得该方法只能对已知的病毒进行检测，对于新病毒的发现较困难。RNA沉默是植物抗病毒的一种机制。当病毒入侵宿主细胞后，RNA病毒的基因组复制中间物或DNA病毒的mRNA转录产物间会形成双链RNA(dsRNA)中间体，这些病毒的dsRNA会被细胞内核酸内切酶Dicer识别并产生病毒的siRNA。本研究利用这种植物抗病毒的机制对这些小干扰RNA进行高通量测序，这些小干扰RNA之间存在相互重叠序列，并且能够被组装成较长的重叠群。因此从病患的植物组织样本中提取出RNA，通过筛选，建立小RNA文库，然后对小RNA进行测序，并组装总小RNA来检测病毒和发现新病毒。本研究是直接对样本中病毒由于复制或转录过程中产生的siRNA进行测序和生物信息学分析，不需要对样本中病毒进行富集和纯化，能同时鉴定样本中存在的所有的病毒。Wu等人利用这种方法发现多种果蝇携带的新病毒[6]。我们用此方法发现了一种新病毒，其同源性与Potato leafroll virus最高，但低于90%，新病毒基因组序列获得及病毒特性有待进一步的研究。

[1] 高瑞.烟草脉带花叶病毒侵染性克隆的构建及其在交叉保护、外源蛋白表达及VIGS中的应用[D].山东农业大学学位论文，2012.

[2]Ding M,Yang C,Zhang L,et al.Occurrence of Chilli veinal mottle virus in Nicotiana tabacum in Yunnan,China [J].Plant Disease,2011,95(3): 357.

[3] Cai JH,Qin BX,Wei XP,et al.Molecular Identification and Characterization of Tomato zonate spot virus in Tobacco in Guangxi,China [J].Plant Disease,2011,95(11): 1483.

[4] Dong JH,Yin YY,Xu XY,et al.First report of Tomato spotted wilt virus in tomato and tobacco in China [J].Journal of Plant Pathology,2010,92 (4S) : S4.107 - S4.122.

[5]魏强,曹博,郭韬等.小干扰RNA抗病毒研究进展[J].生物技术通讯,2010,4: 571-574.

[6]Wu Q,Luo Y,Lu R.Virus discovery by deep sequencing and assembly of virus－derived small silencing RNAs [J].Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107(4): 1606－1611．

[7]陈斌,龚正达,张丽云.利用siRNA高通量测序技术筛查蚊子体内携带的RNA病毒[J]生物信息学,2011,9(3): 189-191.

Detection of tobacco virus by siRNA high-throughput sequencing

WANG Haojun1，WANG Fang2，YAO Zhongda1，GUO Dongfeng1，SHU Junsheng1
1 Technology Center,Anhui Cigarette Industrial Co.Ltd.,Hefei 230088,China；
2 Tobacco Research Institute,Anhui Academy of Agricultural Sciences,Hefei 230031,China

Quick detection of tobacco virus strains and identification of new virus were achieved through 2ndgeneration sequencing technique to perform high throughput sequencing of tobacco siRNA and then screening for RNA virus sequences with bioinformatics methods.Results showed that PVY,CMV,TMV,TVBMV and other virus genomic information were detected in southern part of Anhui tobacco growing areas.Three contigs were identified as partly homologous with Potato leafroll virus,which might be a novel tobacco virus.This research established a new strategy to determine naturally occurred RNA viruses and novel virus in tobacco,and could be applied to virus surveillance in tobacco.

high throughput sequencing;small interference RNA;virus detection

王浩军，王芳，姚忠达,等.利用siRNA高通量测序技术检测烟草病毒[J].中国烟草学报，2015,21（3）

安徽中烟工业有限责任公司科技项目“皖南烟叶烘烤工艺优化与研究”（项目编号：2013132）安徽省烟草公司科技攻关项目“安徽省烟草有害生物调查研究”（项目编号：20100551005）

王浩军(1981—)，硕士，农艺师，主要从事烟叶原料研究工作，Email: ycswhj0721@126.com

舒俊生（1975—），博士，研究员，主要从事产品开发和烟叶原料研究管理工作，Email: shujusheng1975@yahoo.cn

2014-02-04

: WANG Haojun,WANG Fang,YAO Zhongda,et al.Detection of tobacco virus by siRNA high－throughput sequencing [J].Acta Tabacaria Sinica,2015,21(3)