非小细胞肺癌患者血浆EGFR突变表达检测及其临床意义

朱美琴，夏俊贤，徐 敏，陈亦欣，申维玺

(暨南大学第二临床医学院、深圳市人民医院肿瘤内科，广东 深圳518020)

肺癌是当今世界最常见的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌占肺癌总病例数的75% ～85%，由于其缺乏明显的早期临床症状，确诊时患者往往已经处于进展期，总手术切除率低，且对放疗、化疗不敏感，生存时间短、死亡率高［1］。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)靶向治疗的出现为非小细胞肺癌患者带来了一线希望，以吉非替尼、厄洛替尼为代表的EGFR 酪氨酸激酶抑制剂对部分非小细胞肺癌患者有着快速、显著的疗效［2］。但部分复发转移患者无法获得病理组织进行检测。我们用荧光定量PCR 法检测了2012年10月至2014年6月在深圳市人民医院住院的90 例非小细胞肺癌患者肿瘤组织和血浆EGFR 表达，并分析两者的一致性，同时观察了血浆EGFR 水平对非小细胞肺癌患者预后的预测价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2012年10月至2014年6月在深圳市人民医院肿瘤内科住院经组织病理确诊的初治晚期非小细胞肺癌患者90 例，其中男58 例，女32 例;年龄44 ～79 岁，中位年龄50 岁。其中用于EGFR 基因突变检测的标本包括:肺癌手术切除标本(肺癌组织、转移淋巴结、转移组织)25 例、组织学小活检标本(肺穿刺活检、气管镜活检等)65 例。同时取得该90例患者的外周血标本。

1.2 检测方法

1.2.1 DNA 的提取 使用德国QIAGEN 公司的DNA提取试剂盒，严格按照试剂盒说明书要求来提取人类基因组DNA。

肿瘤组织基因组DNA 的提取:将新鲜的肿瘤组织在液氮中研磨成粉，称取50 mg 置于115 mL 离心管中提取基因组DNA，－20 ℃保存备用。

外周血游离DNA 的提取:抽取10 mL 静脉血，静置于EDTA 抗凝管6 h，析出血浆，吸取上层血浆，以12 000 r·min－1离心10 min，连续3 次，吸取上清液200 μL，提取血浆游离DNA，－20 ℃保存备用。

1.2.2 EGFR 突变检测 采用人类EGFR 基因突变荧光PCR 检测试剂盒(厦门艾德生物医药有限公司)检测EGFR 的突变，严格按照试剂盒说明进行操作。

1.2.3 质量控制 控制PCR 和测序反应假阳性的质量控制体系:1)DNA 提取过程中增加无样品空白对照;2)PCR 扩增过程中分别增加一个阳性质控品和一个阴性对照(自制纯化水)。

1.3 结果判定 人类EGFR 基因突变荧光PCR 检测试剂盒反应结束后，确定样品各个反应管的突变Ct值，并确定该样品的外控Ct 值。Ct 值=突变Ct 值－外控Ct 值。Ct 值低于26 为阳性，高于26 为阴性。

1.4 随访和疗效评价 随访内容:患者年龄、性别、吸烟史、肿瘤分期、治疗方案、转移器官数目、内脏侵犯情况、无疾病进展时间、生存时间等。所有患者治疗前后均行CT 或超声检查，然后按照WHO(1981年)制定的实体瘤客观疗效评定标准进行疗效评价。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0 进行统计学分析，率的比较采用χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier 法，比较采用log rank 检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 血浆与肿瘤组织EGFR 突变表达的一致性 90例非小细胞肺癌患者的肿瘤组织中共检测到29 例EGFR 突变，其中25 例患者血浆EGFR 可检测到突变。分析血浆与肿瘤组织中EGFR 突变表达的关系发现，非小细胞肺癌患者的血浆与肿瘤组织中EGFR 突变是一致的。见表1。

表1 非小细胞肺癌患者血浆与肿瘤组织EGFR 突变表达的关系 n(%)

2.2 血浆EGFR 突变表达与非小细胞肺癌临床病理特征的关系 血浆EGFR 突变表达与非小细胞肺癌的病理类型、肿瘤大小、淋巴结转移有关。见表2。

表2 血浆EGFR 突变表达与非小细胞肺癌临床病理特征的关系 n(%)

2.3 生存情况 全组90 例非小细胞肺癌患者均获全程随访，随访时间6 ～24 个月，中位随访期12.5 个月。随访截止时间为2015年1月。随访期内，全组生存21 例，死亡69 例，均死于肿瘤进展。中位无疾病进展时间为5.2(0 ～13)个月，中位生存时间11(3 ～24)个月。

按血浆EGFR 突变表达情况分为2 组，突变组的中位无疾病进展时间4.3(0 ～10)个月，无突变组6.2(0 ～13)个月。无突变组中位无疾病进展时间高于突变组，但比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。

突变组的中位生存时间为10.2 个月，无突变组为11.5 个月。经log rank 检验分析发现，突变组与无突变组的总生存时间差异无统计学意义(P ＞0.05)。

3 讨论

EGFR 靶向治疗的出现为非小细胞肺癌患者带来了一线希望，以吉非替尼、厄洛替尼为代表的EGFR 酪氨酸激酶抑制剂对部分非小细胞肺癌患者有着快速、显著的疗效，这些患者的无疾病进展生存时间和总生存时间得到显著延长［3］。EGFR 是一种蛋白酪氨酸激酶受体，人类的EGFR 基因位于7 号染色体的p13 ～q22 区，全长200 kb，包括28 个外显子，其中外显子19的缺失突变与外显子21 的点突变占所有EGFR 突变的85% ～90%［4］。

进展期肺癌患者一般通过支气管镜下活检、CT 定位下肺穿刺、胸腔镜下活检获取组织标本进行病理诊断，但是这些操作创伤大且获取的肿瘤组织标本量少，很难有足够量的肿瘤组织标本进行EGFR 基因突变的检测。而实体肿瘤(包括肺癌)患者的血液循环中存在游离的肿瘤DNA，其来源主要是肿瘤组织中肿瘤细胞凋亡后，肿瘤细胞内的DNA 释放入人体外周血，经肿瘤组织来源的循环DNA 中基因变异与循环血中DNA 相一致，且肿瘤患者外周血游离DNA 含量比正常健康人增高10 倍［5］，其遗传特性与肿瘤基因组DNA 相同，可以作为组织检测EGFR 突变困难的晚期肺癌患者的补充标本采用。

董强刚等［6］曾对国内文献进行了综合分析，揭示我国非小细胞肺癌中EGFR 基因突变的发生率为34.0%(134/394)。而近年来大量研究［7］亦证明了可以从肺癌患者的外周血中检测到EGFR 突变，且与肿瘤组织的突变情况基本一致。本研究的90 例晚期非小细胞肺癌患者中，肿瘤组织EGFR 突变患者为29例，约占全部患者的32. 2%，与文献报道基本相符。本研究从患者的外周血中检测到的EGFR 突变亦与肿瘤组织的突变情况基本一致。

目前我国临床医生选择应用EGFR 酪氨酸激酶抑制剂一般遵循腺癌、非吸烟、女性等临床指征，然而实践证明单凭临床特点进行筛选还是存在一定的盲目性。郭琛等［8］认为肿瘤组织和外周血中EGFR 突变表达与淋巴结转移有关，但与性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、病理类型无关。而孙晓军等［9］则认为血浆EGFR 突变多发生于肺腺癌患者中。本研究采用荧光定量PCR 法分析了90 例非小细胞肺癌患者血浆EGFR，发现EGFR 突变表达与病理类型、肿瘤大小、淋巴结转移有关，结果与之前的报道类似。外周血EGFR 是肺癌患者肿瘤组织中肿瘤细胞凋亡后，肿瘤细胞内的DNA 释放入人体外周血，而肿瘤负荷大的患者更容易释放出游离肿瘤DNA。

在本研究中，我们并没有发现血浆EGFR 突变与无疾病进展时间、生存时间的长短相关，这个结论跟Ciledag 等［10］的结果是一致的。而王勇等［11］分析了术前外周血EGFR 与生存情况的关系，发现术前EGFR 高表达组的生存时间较低表达组显著缩短。

综上所述，本研究通过对90 例非小细胞肺癌患者血浆EGFR 和肿瘤组织EGFR 突变表达情况的检测，发现两者之间有较好的一致性。并且血浆EGFR 突变表达与病理类型、肿瘤大小、淋巴结转移有关。但本研究的结果不支持以血浆EGFR 突变表达作为非小细胞肺癌患者独立的预后指标。因此仍需加大样本量进一步的研究。

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［6］董强刚，黄进肃，黄建，等. 肺癌靶向治疗研究进展和我国肺癌的EGFR 基因突变概况［J］.肿瘤，2005，25 (6):625－634.

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［9］孙晓军，李杰.非小细胞肺癌患者血浆表皮生长因子受体基因突变检测及其临床意义［J］.中华临床医师杂志:电子版，2013，7(7 ):2833－2837.

［10］Ciledag A，Kaya A，Yetkin O，et al. The prognostic value of serum epidermal growth factor receptor level in patients with non-small cell lung cancer［J］.Tuberk Toraks，2008，56(4):390－395.

［11］王勇，李俊杰，王小平.非小细胞肺癌患者手术前后血清EGFR水平变化在预后判断中的应用价值［J］. 解放军医药杂志，2014，26(4):55－67.