RGC-32和ZEB1在胃癌组织中的表达

夏祥伟，茅国新

(高邮市人民医院，江苏 扬州225600)

胃癌是消化系统常见恶性肿瘤，在我国及日本发病率、死亡率均较高，目前其发、发展的机制并不十分清楚。胃癌的发生、发展是一个多阶段、多步骤的过程，主要机制包括原癌基因的激活、黏附机制的失调及抑癌基因的失活等。补体反应基因－ 32(response gene to complement-32，RGC-32)是一种新发现的补体激活基因，RGC-32 基因的表达异常会导致细胞转化，在肿瘤转移浸润等过程中起关键作用［1］，现已发现在人类多种肿瘤组织中存在RGC-32 的异常表达。锌指E 盒结合蛋白(zinc-finger E-box-binding homeobox factor 1，ZEB1)是锌指结构转录因子家族的重要一员，是胚胎发育中关键转录因子，是细胞分化和胚胎发育的重要分子，ZEB1 在肿瘤发生、发展过程中起到重要作用。ZEBl 通过多种途径抑制了E－钙黏蛋白及其他相关蛋白的表达，增加多种肿瘤的侵袭和广泛转移的能力。本研究应用免疫组化S-P 法检测RGC-32 及ZEB1 在胃癌、癌前病变及癌旁正常胃黏膜组织中的表达情况，并分析两者与胃癌临床病理特征的关系。

1 材料与方法

1.1 一般材料 收集2011年1月至2013年12月高邮人民医院收治的术后胃癌标本60 例、癌前病变组织60 例(来源胃镜组织活检)及癌旁正常胃黏膜组织20例。所有标本均具有完整的临床及病理资料。胃癌患者术前均未接任何抗肿瘤治疗。

1.2 方法 标本经过质量分数4%中性多聚甲醛固定，石蜡包埋，4 μm 切片，然后采用免疫组化S-P 法进行RGC-32 和ZEB1 的表达，所用一抗为兔抗人RGC-32和ZEB1 抗体，操作按照说明进行，用已知RGC-32 和ZEB1 阳性组织作为阳性对照，PBS 代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果评判标准 双盲法随机计数1 000 个细胞，计算出阳性细胞所占比例，阳性反应程度根据阳性细胞所占比例进行分级。

RGC-32 阳性信号表现为棕黄色，主要位于细胞膜、细胞质中，以阳性细胞的所占比例为标准:每张组织切片随机抽取10 个视野，每个视野观察100 个细胞，记录染色为阳性的细胞数，最后结果取各组的平均值，阳性细胞所占的比例换算百分率:0 ～5%为阴性(－)，＞5% ～25%为弱阳性(+)、＞25% ～50%为中等阳性(+ +)、＞50%为强阳性(+ + +)，其中强阳性、中等阳性归为阳性表达，而弱阳性、阴性归为阴性表达。

ZEB1 阳性信号为淡黄色、棕黄色或棕褐色，定位于细胞核和细胞质，以阳性细胞所占比例为标准:每张切片随机抽取10 个视野，每个视野观察100 个细胞，计算染色为阳性的细胞数，最后结果取各组的平均值，阳性细胞所占的比例换算百分率:0 ～5% 为阴性(－)，＞5% ～25%为弱阳性(+)、＞25% ～50%为中等阳性(+ +)、＞50%为强阳性(+ + +)，其中强阳性、中等阳性归为阳性表达，而弱阳性、阴性归为阴性表达。

1.4 统计学处理 应用SPSS 19.0 对数据进行分析，应用χ2检验对RGC-32 和ZEB1 在胃癌、癌前病变和正常胃黏膜组织中的表达以及两者与胃癌各临床病理特征间的关系进行分析，采用χ2检验及Spearman 等级相关检验对两者在胃癌组织中的相关性进行分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 RGC-32 在不同胃组织中的表达 60 例胃癌组织中47 例阳性表达(78.3%)，60 例癌前病变组织中25 例阳性表达(41.7%)，20 例正常胃黏膜组织中8例阳性表达(40.0%)(χ2=19.269，P ＜0.001)，提示胃癌、癌前病变和正常胃黏膜组织中RGC-32 蛋白阳性表达率逐渐降低。见图1、表1。

2.2 ZEB1 在胃癌、癌前病变及正常胃黏膜中的表达60 例胃癌组织中阳性表达53 例(88.3%)，60 例癌前病变组织中阳性表达30 例(50.0%)，20 例正常胃黏膜组织中4 例表达阳性(20.0%)(χ2=36.354，P ＜0.001)，提示胃癌、癌前病变和正常胃黏膜中的ZEB1蛋白阳性表达率逐渐降低。见图2、表1。

图1 RGC-32 在不同胃组织中的表达(S-P，×400)

图2 ZEB1 在不同胃组织中的表达(S-P，×400)

表1 RGC-32 和ZEB1 在不同胃组织中的表达

2.3 胃癌组织中RGC-32 和ZEB1 的表达与起临床病理特征之间的关系 胃癌组织中RGC-32 和ZEB1的表达与胃癌的病理分化程度、TNM 分期和淋巴结转移有关(P ＜0.05)。见表2。

2.4 不同胃组织中RGC-32 和ZEB1 表达的相关性胃癌组织中RGC-32、ZEB1 同时阳性47 例，同时阴性7 例，RGC-32 阳性而ZEB 阴性0 例，RGC-32 阴性而ZEB1 阳性6 例。统计分析结果显示，RGC-32 和ZEB1 在胃癌组织中的表达呈正相关(r =0.568，P ＜0.001)。

癌前病变组织中RGC-32 和ZEB1 同时阳性20例，同时阴性25 例，RGC-32 阳性而ZEB1 阴性5 例，RGC-32 阴性而ZEB1 阳性10 例。统计分析结果显示，RGC-32 和ZEB1 在癌前病变组织中的表达呈正相关(r=0.452，P ＜0.001)。

正常胃黏膜组织中RGC-32 和ZEB1 同时阳性3例，同时阴性11 例，RGC-32 阳性而ZEB1 阴性5 例，RGC-32 阴性而ZEB1 阳性1 例。统计分析结果显示，RGC-32 和ZEB1 在正常胃黏膜组织中的表达无明显相关(r=0.336，P=0.110)。

3 讨论

胃癌是我国发病率、死亡率较高的恶性肿瘤之一，但是其发生、发展的机制目前并不十分清楚。RGC-32是一种新发现的补体激活基因，RGC-32 基因的异常表达会促进细胞转化，RGC-32 的异常表达在人类多种肿瘤组织中。RGC-32 在肿瘤发生、发展中的作用不明确，更多的研究寻找其在肿瘤发生、发展过程中的作用。ZEB1 可以降低IL-2、p73、GATA-3、collagenI/Ⅱ等基因的表达，并可通过负性调控E－钙黏蛋白的表 达，增强肿瘤细胞的侵袭和转移。

表2 胃癌组织中RGC-32、ZEB1 表达与其临床病理学特征之间的关系

人类RGC-32 基因位于13q14.11，与白鼠类RGC-32 蛋白具有92%的同源性［1－2］，RGC-32 表达在人类多种组织和器官中，参与多种细胞生物学过程，是新发现的补体激活基因［3－5］。RGC-32 在不同肿瘤中的作用各异，在肿瘤发生、发展中的作用及机制不明确。Zhu 等［6］研究报道，RGC-32 在胰腺癌组织中的表达明显高于慢性胰腺炎和正常胰腺组织，同时发现其表达与淋巴结转移及TNM 分期有关(P 均＜0.05)，认为RGC-32 是胰腺癌的转移促进因子之一，在研究中还发现，胰腺癌组织中RGC-32 的阳性表达率和E－钙黏蛋白的阳性表达率呈正相关(r =0.458，P ＜0.01)，猜测RGC-32 参与了胰腺癌的上皮间质转化过程，从而促进其侵袭和转移。Fosbrink 等［7］发现结肠癌组织中RCC-32 蛋白的表达上调更为显著，他发现结肠癌组织中RGC-32 蛋白的表达水平明显增高。Vlaicu 等［8］发现高表达RGC-32 与结直肠癌的转移明显相关。体外实验［9］发现，上调的RGC-32 蛋白通过NF-κB 信号途径促进肺癌细胞的侵袭和发生上皮间质转化过程。研究［10］发现RGC-32 的过表达促进细胞骨架重组，有利于细胞运动，推测细胞骨架重组是RGC-32 促进肿瘤转移的重要机制。

研究［6］发现:RGC-32 在胰腺癌、慢性胰腺炎及正常胰腺组织中均有表达，其表达于胰腺腺泡细胞的细胞质中，染色均一，呈棕褐色，RGC-32 在胰腺癌组织中的染色强度最强，阳性表达率高于慢性胰腺炎及正常胰腺组织。胃癌组织及正常胃组织中RGC-32 表达部位目前尚未见报道，研究显示其在人类很多肿瘤中都有表达，然而其在肿瘤形成及发展中的作用机制仍存在争议，一方面，有报道称，在多发性骨髓瘤、子宫内膜癌、侵袭性前列腺癌等肿瘤组织中RGC-32 表达下降，提示其为抑癌基因［4］;另一方面，在胰腺癌、卵巢癌、结肠癌、乳癌等肿瘤组织中表达上调，提示为癌基因，体外研究证实RGC-32 在胰腺癌细胞介导TGF-β 诱导的上皮间质转化和转移，提示其为癌基因［6－7，11］。本研究发现:正常胃组织、癌前病变组织、胃癌组织中的RGC-32 阳性表达率逐渐增高，其可能参与了胃癌的发生、发展过程。RGC-32 蛋白的阳性表达与胃癌的病理分化程度、TNM 分期和淋巴结转移有关(P 均＜0.05)，提示RGC-32 的表达参与了胃癌的发生、发展。

ZEB1 是锌指结构转录因子家族的重要成员之一，也是胚胎发育中所必须的转录因子。ZEB1 是细胞分化和胚胎发育的关键影响因素，ZEB1 的表达在肿瘤生物学中起重要作用，抑制E－钙黏蛋白表达，增加肿瘤的侵袭及转移能力。ZEB1 在多种肿瘤组织中高表达，如乳腺癌、骨转移性小细胞肺癌、肝癌等，且高表达预示着较差的预后。Jia 等［12］运用免疫组化S-P法分别检测45 例胃癌、癌旁正常胃黏膜组织中ZEB1的表达，结果提示:胃癌组织中ZEB1 的阳性表达率明显高于癌旁正常胃黏膜组织，进一步数据分析发现，ZEB1 蛋白的表达在低分化癌组织和TNM 高分期组织中明显升高。本研究结果提示:正常胃黏膜组织、癌前病变组织、胃癌组织中的ZEB1 阳性表达率逐渐增高，说明ZEB1 可能参与了正常胃黏膜组织至胃癌的发生、发展演变过程。ZEB1 蛋白的阳性表达与胃癌的病理分化程度、TNM 分期和淋巴结转移有关(P 均＜0.05)，提示ZEB1 的表达与胃癌的发生密切相关。RGC-32 与ZEB1 在胃癌中的关系目前尚未见报道，本研究发现两者在胃癌组织、癌前病变组织中的表达呈正相关关系，提示RGC-32 和ZEB1 可能通过某个中间产物共同介导胃癌细胞的癌变、侵袭和转移。

综上所述，RGC-32 和ZEB1 与胃癌细胞的癌变、侵袭和转移密切相关，联合检测RGC-32 和ZEB1 蛋白的表达，对胃癌的早期诊断及判断肿瘤的恶性程度、预后有重要作用。探索以RGC-32 和ZEB1 为靶点的治疗，为胃癌的治疗提供一条新思路。但是，有关RGC-32 与ZEB1 在胃癌组织中的表达与临床预后的具体关系有待进一步随访观察。

［1］Badea TC，Niculescu FI，Soane L，et al.Molecular cloning and characterization of RGC-32，a novel gene induced by complement activation in oligodendrocytes［J］. J Biol Chem，1998，273 (41):26977－26981.

［2］Badea T，Niculescu F，Soane L，et al.RGC-32 increases p34CDC2 kinase activity and entry of aortic smooth muscle cells into S-phase［J］.J Biol Chem，2002，277(1):502－508.

［3］朱亮，赵秋，李德民，等.过表达RGC-32 对胰腺癌BxPC-3 细胞增殖、凋亡的影响［J］.胃肠病学和肝病学杂志，2014，23(11):1347－1350.

［4］Vlaicu SI，Cudrici C，Ito T，et al.Role of response gene to complement 32 in diseases［J］.Arch Immunol Ther Exp (Warsz)，2008，56(2):115－122.

［5］Li F，Luo Z，Huang W，et al. Response gene to complement 32，a novel regulator for transforming growth factor-beta-induced smooth muscle differentiation of neural crest cells［J］.J Biol Chem，2007，282(14):10133－10137.

［6］Zhu L，Qin H，Li PY，et al. Response gene to complement-32 enhances metastatic phenotype by mediating transforming growth factor beta-induced epithelial-mesenchymal transition in human pancreatic cancer cell line BxPC-3［J］.J Exp Clin Cancer Res，2012，31:29.

［7］Fosbrink M，Cudrici C，Niculescu F，et al.Overexpression of RGC-32 in colon cancer and other tumors［J］.Exp Mol Pathol，2005，78(2):116－122.

［8］Vlaicu SI，Tegla CA，Cudrici CD，et al.Epigenetic modifications induced by RGC-32 in colon cancer［J］. Exp Mol Pathol，2010，88(1):67－76.

［9］Sun Q，Yao X，Ning Y，et al. Overexpression of response gene to complement 32 (RGC32)promotes cell invasion and induces epithelial-mesenchymal transition in lung cancer cells via the NF-κB signaling pathway［J］.Tumour Biol，2013，34(5):2995－3002.

［10］田杰，徐川，杨敏慧，等. 补体应答基因-32 过表达对SW480 细胞骨架的影响［J］. 南方医科大学学报，2011，31(7):1179－1182.

［11］Vlaicu SI，Cudrici C，Ito T，et al.Role of response gene to complement 32 in diseases［J］.Arch Immunol Ther Exp (Warsz)，2008，56(2):115－122.

［12］Jia B，Liu H，Kong Q，Li B.Overexpression of ZEB1 associated with metastasis and invasion in patients with gastric carcinoma［J］.Mol Cell Biochem，2012，366(1－2):223－229.