鸡TLR4基因抗沙门氏菌的研究进展

胡文元 李琦华豆腾飞 荣 华葛长荣 贾俊静刘丽仙，2* （云南农业大学，昆明65020；2云 南 农业职业技术学院，昆明 65003)

沙门氏菌感染引起的畜禽疾病给当代养殖业造成了严重的危害，使得沙门氏菌病成为焦点而被持续争论和关注。由于该病呈垂直和水平两种方式传播，且隐性感染家禽不能被及时发现，使得控制和解决沙门氏菌污染成为世界性的难题。

目前控制该病多利用净化手段和饲喂抗生素的方法，然而由于抗生素的大量使用使得耐药菌株不断出现且造成了抗生素残留问题。由于沙门氏菌感染与机体状况有关，所以，在抵抗沙门氏菌感染过程中机体自身固有的免疫系统起到了决定性的作用。因此，寻找与免疫相关的候选基因至关重要。研究发现TLR4基因可作为抗沙门氏菌感染的候选基因。TLR4作为内毒素脂多糖(LPS)最重要的模式识别受体，不仅是连接获得性免疫和先天性免疫的桥梁，在抗感染过程中调节获得性免疫，发挥着天然免疫的作用，还在介导革兰氏阴性菌及其LPS的宿主反应中发挥着重要作用[1]。

1 TLR4基因的结构分布

HashimotoC等在研究果蝇胚胎发育中发现了Toll样受体[2]。自1997年以后，与Toll类似的一组蛋白被研究者陆续发现，称为Toll样受体，TLR4是TLRs家族的重要成员之一，首先由Medzhitov等[3]发现。到目前为止至少有13种TLRs被发现，在鸡上已发现11种。作为机体的第一道防线，它们在机体各组织中广泛分布，并能特异性识别大量病原体及组织代谢产物，为机体抵抗外源病菌入侵提供可靠保障。

在家禽及其抗沙门氏菌感染与免疫的研究上，对于TLR4的研究还处于初级阶段。Leveque等[4]通过比较基因组学方法，首次克隆了鸡的TLR4基因。该基因定位于鸡17号染色体上，编码843个氨基酸，序列全长4452bp，共有3个外显子，2个内含子。由于第三外显子较长，为2260bp，因此鸡TLR4基因的SNP主要集中在第三外显子区域。鸡TLR4的两个内含子区域分别为934bp和984bp。2个内含子区域也含有较为丰富的SNP，这些SNP与外显子的SNP为研究SNP与鸡抗革兰氏阴性菌的关系提供了丰富的遗传材料。

2 鸡TLR4基因的研究进展

2.1 沙门氏菌感染对TLR4基因表达的影响

目前研究表明，家禽的肠道和脾脏在抵抗沙门氏菌感染的局部免疫反应中起着至关重要的作用。Abasht等[5]对鸡感染沙门氏菌后机体内各组织器官TLRs的mRNA的表达情况进行研究，发现不同品系的鸡群中，Fayouni鸡与来航鸡相比，TLR4在盲肠和脾脏中的表达量差异显著。感染组与对照组相比，雏鸡肠炎沙门氏菌感染后，TLR4基因的表达水平在盲肠和脾脏中明显上调，并通过分析发现在盲肠中TLR4的表达量与盲肠的沙门氏菌载菌量呈极显著相关[6]。李鹏等[7]研究表明，感染沙门氏菌组TLR4基因的表达量显著高于对照组，并在感染后的第3和第7天mRNA的表达量达到了极显著水平。Sadeyen等[8]通过对鸡沙门氏菌易感和抗性品系进行TLR4基因mRNA表达水平的试验，试验结果表明，在沙门氏菌感染7天后，TLR4基因在抗性品系鸡的组织器官中的表达水平极显著高于易感品系鸡，同时还发现，一氧化氮合成酶基因的表达量在抗病品系鸡中也极显著高于易感品系，说明了TLR4基因的表达量与机体免疫相关基因存在着不同程度的相关性，同时也表明了在发挥调节作用的细胞因子帮助下，TLR4基因可能为宿主提供沙门氏菌感染的危险信号。所以沙门氏菌感染与TLR4基因的表达水平存在着紧密的相关性。

2.2 沙门氏菌感染与TLR4基因多态性的关系

目前对于沙门氏菌感染与鸡TLR4基因的多态性的关系[9]的研究进展比较缓慢。研究表明，鸡TLR4基因第三外显子上有2个突变位点，可造成编码TLR4蛋白的氨基酸发生改变，进而引起机体对沙门氏菌感染产生不同反应[10，11]。宋咏梅等[12]利用基因组直接测序法对引进品种鸡和地方品种鸡进行TLR4基因的部分序列单核苷酸多态性检测，SNP检测发现，共检测到36个多态性位点，并发现TLR4基因编码序列的突变位点与机体对于病原菌的抗性具有重要作用。还有研究表明，鸡TLR4基因上的突变可能与机体沙门氏菌载菌量相关。Beaumont等[13]研究报道鸡TLR4与沙门氏菌易感性相关，试验以产蛋母鸡为研究素材，在TRL4序列中共发现3个SNPs，这些突变位点与某些组织器官的沙门氏菌载菌量有一定的相关性，尤其是在盲肠和卵巢中显著相关。Malek等[14]对鸡的遗传资源群体进行了TLR4基因内含子区域的单核苷酸多态性检测，结果发现在TLR4基因内含子区域发现1个G156C的SNP突变位点。进一步做关联分析表明，该SNP与脾脏载菌量呈中度相关，并且还发现TLR4基因与鸡抗沙门氏菌感染存在一定相关。Leveque等[4]以沙门氏菌抗感和易感品系作比较，通过序列遗传变异分析发现，在TLR4基因第三外显子编码区域共发现TLR4基因的14个突变位点。经预测分析表明，在保守区域有5个位点发生突变进而导致氨基酸的改变；在非保守区域的2个突变位点导致了氨基酸发生改变，而且这2个突变位点引起氨基酸改变仅存在于易感品系的商品代鸡的基因组信息中。因此，Leveque等表明，TLR4基因有可能为宿主抗沙门氏菌感染相关的候选免疫基因。刘艳等[15]以红色原鸡与14个地方品种鸡为试验对象，通过PCR-SSCP技术对TLR4基因第二外显子的多态性进行检测，结果基因分型发现在第二外显子区域有3种基因型AA、AB和BB，分析认为BB基因型可能是机体免疫应答的有利基因型，对于抗沙门氏菌感染具有一定的免疫应答作用。陶志云等[16]对我国4个地方鸡种的TLR4基因第2内含子区域进行多态性分析发现，在1 894bp处有1个为G-C替换的SNP位点，这一SNP导致种间基因型差异显著，并推测出品种间对特定病原菌及其所引发的免疫反应类型具有较大差异。因此研究表明，TLR4基因很有可能为宿主抗沙门氏菌感染相关的候选免疫基因。

3 展望

采用免疫遗传学原理筛选与沙门氏菌感染有关的抗病基因可为选育抗病新品种提供可靠依据。因此，探索TLR4基因的作用机制为寻找预防和治疗沙门氏菌感染提供了新的思路和方法，为畜禽的分子标记辅助选育、抗病品种选育和疾病防治等方面的研究提供理论依据。

[1]温乐.LPS和沙门氏菌刺激时鸡脑内TLR4的表达规律研究［D］.武汉：华中农业大学,2014.

[2]Hashimoto C，Hudson K L，Anderson K V.The Toll gene of Drosophila，required for dorsal ventral embryonic polarity，appears to encode a transmembrane protein[J].Cell，1988，52(2):269-279.

[3]Medzhitov R，Preston-Hurburt P，Janeway CA.A human homologue of the Drosophila Tollprotein signals activation of adaptor immunity[J].Nature，1997，388：394-7.

[4]Leveque G，Forgetta V，Morroll S，et al.Allelic variation in TLR4 is linked to susceptibility to Salmonella enterica serovar Typhimurium infectionin chickens[J].Infect Immun，2003，71(3)：1116-24.

[5]Abasht B，Kaiser M.G，Van der Poel J，Lamont S.J.Genetic lines differ in Toll-like receptor gene expression in spleens of chicks inpculated with Salmonella enterica serovar Enteritidis[J].Poultry Sci,2009,88(4):744-749.

[6]AbashtB.KaiserM.G.LamontS.J.Toll-like receptor gene expression in cecum,spleen of advanced intercross line chicks infected with Salmonella enterica serovar Enteritidis[J].Veterinary Immunology,Immunopathology,2008,123(3-4):314-323.

[7]李鹏，夏平安，宋咏梅，等.鸡TLR4基因表达水平与沙门氏菌感染关系的研究[J].中国畜牧兽医,2009,36(5):72-4.

[8]Sadeyen JR，Trotereau J，Protais J，et al.Salmonella carrierstate in hens:study ofhost resistance by a gene expression approach.Microb Inf，2006，8：1308-14.

[9]孙钰.TLR4基因的变异分析及TLRs基因与鸡沙门氏菌感染的相关性研究.［D］.山东：山东农业大学,2013.

[10]赵兴旺.鸡TLR4不同突变基因型对抗肠炎沙门氏菌感染的差异［D］.北京：北京畜牧兽医研究所,2011.

[11]宋咏梅.鸡TLR4信号通路与肠炎沙门氏菌感染关系的研究［D］.北京：中国农业科学院，2010.

[12]宋咏梅，庞建建，赵桂苹，等.TLR4基因SNP检测及在中外鸡种中的群体变异分析［J］.中国农学通报，2010，26（16）：1-7.

[13]Beaumont C，Protais J，Pitel F，et al.Effect of two candidate genes on the Salmonella carrier state in fowl[J].Poultry Science，2003，82(5)：721.

[14]Malek M，Hasenstein J R，Lamont S J.Analysis of chicken TLR4，CD28，MIF，MD-2，and LITAFgenes in a Salmonella enteritidis resource population[J].Poultry Science，2004，83(4)：544-549.

[15]刘艳，包文斌，常国斌，等.14个鸡品种和红原鸡TLR4基因外显子2多态性分析[C].中国动物遗传育种研究进展——第十五次全国动物遗传育种学术讨论会论文集，2009，40.

[16]陶志云，徐文娟，宋卫涛，等.4个品种鸡Toll样受体4基因第2内含子的多态性分析[J].中国畜牧兽医，2013，40（1）：145-148.